Применение липолитического фермента в пищевой промышленности

Применение липолитического фермента в пищевой промышленности

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к новому липолитическому ферменту, в частности к новому липолитическому ферменту и к кодирующим его нуклеотидным последовательностям. Настоящее изобретение также относится к способам получения нового липолитического фермента и к его применениям. Настоящее изобретение относится также к способам и применениям липолитического фермента.

ПРЕДШЕСТВУЮЩАЯ ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Полезное применение липолитических ферментов, действующих на гликолипиды, в изготовлении хлеба объясняют в EP 1193314. Объясняют, что обнаружили, что продукты частичного гидролиза лизогликолипидов обладают очень высокой эмульгирующей активностью. Однако обнаружено, что ферменты, указанные в EP 1193314, обладают также значительной неселективной активностью в отношении триглицеридов, что приводит к чрезмерному повышению уровня свободной жирной кислоты.

Липолитический фермент из Fusarium oxysporum, обладающий фосфолипазной активностью, указан в EP 0869167. Этот липолитический фермент обладает высокой гидролизующей триацилглицериды (липазной) активностью. В настоящее время этот фермент выпускается Novozymes A/S (Denmark) как Lipopan F™.

В WO 02/00852 описаны пять липазных ферментов и кодирующих их полинуклеотидов, выделенных из Fusarium venenatum, F. sulphureum, Aspergillus berkeleyanum, F. culmorum и F. solani. Все пять ферментов описаны как обладающие высокой гидролизующей триацилглицерин активностью, фосфолипазной и галактолипазной активностью.

Получены варианты липолитических ферментов с конкретными аминокислотными заменами и слитые белки; некоторые из них обладают усиленной активностью в отношении полярных липидов по сравнению с исходными ферментами дикого типа. В 01/39602 описан такой вариант, названный SP979, который является слитым белком липазы Thermomyces lanuginosus, и липаза Fusarium oxysporum описана в EP 0869167. Обнаружено, что этот вариант обладает значительно высокой степенью активности в отношении фосфолипидов и гликолипидов по сравнению с триглицеридами.

В WO 02/094123 обнаружили, что можно достичь улучшенной функциональности выбором липолитических ферментов, активных в отношении полярных липидов (гликолипидов и фосфолипидов) в тесте, но, в основном, не активных в отношении триглицеридов или 1-моноглицеридов.

В находящейся одновременно на рассмотрении заявке PCT номер PCT/DB2005/000875 описаны липолитические ферменты дикого типа, обладающие более высокой степенью активности в отношении полярных липидов по сравнению с триглицеридами. Однако в этом документе не указывают липолитических ферментов из видов Streptomyces, Thermobifida или Corynebacterium.

До настоящего изобретения не опубликовано липолитических ферментов из видов Streptomyces, обладающих активностью или значительной активностью в отношении гликолипидов. Аналогично, не опубликовано липолитических ферментов из видов Thermobifida или видов Corynebacterium, обладающих активностью или значительной активностью в отношении гликолипидов. Хотя липазы, т.е. гидролизующие триацилглицерин ферменты, выделены из видов Streptomyces (см., например, Vujaklija et al Arch Microbiol (2002) 178: 124-130), эти ферменты не были идентифицированы как обладающие гидролизующей гликолипид активностью.

АСПЕКТЫ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение основано на основополагающем обнаружении липолитического фермента, обладающего значительной активностью для галактолипидов, из рода Streptomyces. В частности, липолитический фермент из рода Streptomyces обладает значительной гидролизующей галактолипид активностью и/или значительной ацилтрансферазной активностью для галактолипида, особенно при применении в способах и применениях по настоящему изобретению.

Кроме того, настоящее изобретение основано на основополагающем открытии, что липолитические ферменты из родов Thermobifida или Corynebacterium обладают значительной активностью в отношении галактолипида. В частности, липолитические ферменты из родов Thermobifida или Corynebacterium обладают значительной гидролизующей галактолипиды активностью и/или значительной ацилтрансферазной активностью в отношении галактолипида, особенно при применении в способах и применениях по настоящему изобретению.

В широком аспекте настоящее изобретение относится к липолитическому ферменту, способному гидролизовать по меньшей мере гликолипиды и/или способному переносить ацильную группу по меньшей мере от гликолипида к одному или нескольким субстратам - акцепторам ацила, где фермент может быть получен, предпочтительно, получен из видов Streptomyces.

В следующем аспекте настоящее изобретение относится к липолитическому ферменту, способному гидролизовать по меньшей мере галактолипиды и/или способному переносить ацильную группу по меньшей мере от галактолипида к одному или нескольким субстратам - акцепторам ацила, где фермент кодирует нуклеиновая кислота, выбранная из группы, состоящей из:

a) нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, показанную на SEQ ID No 3;

b) нуклеиновой кислоты, родственной нуклеотидной последовательности SEQ ID No 3 вследствие вырожденности генетического кода; и

c) нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, по меньшей мере на 70% идентичную нуклеотидной последовательности, показанной на SEQ ID No 3.

Настоящее изобретение также относится к липолитическому ферменту, содержащему аминокислотную последовательность, как показано на SEQ ID No 4, или аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 60% идентичную ей.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к липолитическому ферменту, способному гидролизовать по меньшей мере галактолипид и/или способному переносить ацильную группу по меньшей мере от галактолипида к одному или нескольким субстратам - акцепторам ацила, где фермент содержит аминокислотную последовательность, как показано на SEQ ED No. 4, или аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 60% идентичную ей.

В следующем аспекте настоящее изобретение относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей липолитический фермент, содержащий аминокислотную последовательность, как показано на SEQ ID No 4, или аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 60% идентичную ей.

SEQ ID No 3 показан на фигуре 3, и SEQ ID No4 показан на фигуре 4.

Настоящее изобретение также относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей липолитический фермент, где нуклеиновую кислоту выбирают из группы, состоящей из:

a) нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, показанную на SEQ ID No 3;

b) нуклеиновой кислоты, родственной нуклеотидной последовательности SEQ ID No 3 вследствие вырожденности генетического кода; и

c) нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, по меньшей мере на 70% идентичную нуклеотидной последовательности, показанной на SEQ ID No 3.

Настоящее изобретение также относится к применению липолитического фермента по настоящему изобретению на субстрате (предпочтительно, пищевом продукте) для получения лизогликолипида, например дигалактозилмоноглицерида (DGMG) или моногалактозилмоноглицерида (MGMG) посредством обработки гликолипида (например, дигалактозилдиглицерида (DGDG) или моногалактозилдиглицерида (MGDG)) липолитическим ферментом по настоящему изобретению для получения продукта частичного гидролиза, т.е. лизогликолипида.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению липолитического фермента по настоящему изобретению на субстрате (предпочтительно, пищевом продукте) для получения лизофосфолипида, например лизолецитина, посредством обработки фосфолипида (например, лецитина) ферментом по настоящему изобретению для получения продукта частичного гидролиза, т.е. лизофосфолипида.

В одном из общих аспектов настоящее изобретение относится к способу получения пищевого продукта, включающему смешивание липолитического фермента по настоящему изобретению с одним или несколькими ингредиентами пищевого продукта.

В другом общем аспекте настоящее изобретение относится к способу получения выпеченного продукта из теста, включающему смешивание липолитического фермента по настоящему изобретению с тестом.

В следующем аспекте настоящее изобретение относится к способу получения молочного продукта, включающему смешивание липолитического фермента по настоящему изобретению с одним или несколькими ингредиентами молочного продукта.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению липолитического фермента по настоящему изобретению в производстве молочного продукта для уменьшения одного или нескольких из следующих неблагоприятных эффектов: неприятный запах и/или неприятный и/или мыльный вкус.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению липолитического фермента по настоящему изобретению в способе обработки яйца или продуктов на основе яиц для получения лизофосфолипидов.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению липолитического фермента по настоящему изобретению в способе обработки яйца или продуктов на основе яиц для получения лизогликолипидов.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу ферментативного рафинирования растительных или пищевых масел, включающему обработку пищевого или растительного масла липолитическим ферментом по настоящему изобретению так, чтобы гидролизовать большую часть полярных липидов (например, фосфолипид и/или гликолипид).

В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению липолитического фермента по настоящему изобретению в способе, включающем обработку фосфолипида так, чтобы гидролизовать жирные ацильные группы.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению липолитического фермента по настоящему изобретению в способе для уменьшения содержания фосфолипида в пищевом масле, включающем обработку масла липолитическим ферментом по настоящему изобретению так, чтобы гидролизовать большую часть фосфолипида, и отделение водной фазы, содержащей гидролизованный фосфолипид, от масла.

Изобретение также относится к способу получения липолитического фермента по настоящему изобретению, включающему трансформацию клетки-хозяина рекомбинантной нуклеиновой кислотой, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую липолитический фермент, где клетка-хозяин способна экспрессировать нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид липолитического фермента, культивирование трансформированной клетки-хозяина в условиях, где нуклеиновая кислота экспрессируется, и сбор липолитического фермента.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению липолитического фермента по настоящему изобретению в биоконверсии полярных липидов (предпочтительно, гликолипидов) для получения ценных продуктов, таких как сложные эфиры углеводорода, и/или сложные эфиры белка, и/или сложные эфиры субъединицы белка, и/или сложный эфир оксикислоты.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению липолитического фермента по настоящему изобретению в способе ферментативного рафинирования растительного или пищевого масла, включающем обработку указанного пищевого или растительного масла указанным липолитическим ферментом так, чтобы гидролизовать большую часть полярных липидов.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению липолитического фермента по настоящему изобретению в способе, включающем обработку фосфолипида так, чтобы гидролизовать жирные ацильные группы.

Настоящее изобретение также относится к иммобилизованному липолитическому ферменту по настоящему изобретению.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения лизогликолипида, включающему обработку содержащего гликолипид субстрата по меньшей мере одним липолитическим ферментом для получения указанного лизогликолипида, где указанный липолитический фермент обладает гликолипазной активностью, и где указанный липолитический фермент может быть получен из одного из следующих родов: Streptomyces, Corynebacterium и Thermobifida.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения лизофосфолипида, включающему обработку содержащего фосфолипид субстрата по меньшей мере одним липолитическим ферментом для получения указанного лизофосфолипида, где указанный липолитический фермент обладает фосфолипазной активностью и где указанный липолитический фермент является получаемым из одного из следующих родов: Streptomyces, Corynebacterium и Thermobifida.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу ферментативного рафинирования растительного или пищевого масла, включающему обработку указанного пищевого или растительного масла липолитическим ферментом, получаемым из одного из следующих родов: Streptomyces, Corynebacterium и Thermobifida, способным гидролизовать большую часть полярных липидов.

Настоящее изобретение далее относится к способу биоконверсии полярных липидов для получения ценных продуктов, включающему обработку указанных полярных липидов липолитическим ферментом, который может быть получен из одного их следующих родов: Streptomyces, Corynebacterium и Thermobifida, для получения указанных ценных продуктов, где указанный липолитический фермент способен гидролизовать указанные полярные липиды.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения пищевого продукта, включающему смешивание по меньшей мере одного липолитического фермента с одним или несколькими ингредиентами пищевого продукта, где указанный липолитический фермент способен гидролизовать гликолипид и/или фосфолипид, присутствующий по меньшей мере в одном из указанных ингредиентов или в качестве него, и где указанный липолитический фермент можно получить из одного из следующих родов: Streptomyces, Corynebacterium и Thermobifida.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению липолитического фермента на субстрате для получения лизофосфолипида, где указанный липолитический фермент обладает фосфолипазной активностью, и где указанный липолитический фермент можно получить из одного из следующих: Streptomyces, Corynebacterium и Thermobifida.

Настоящее изобретение также относится к применению липолитического фермента, который может быть получен из одного из следующих родов: Streptomyces, Corynebacterium и Thermobifida, для ферментативного рафинирования растительного или пищевого масла так, чтобы гидролизовать большую часть полярных липидов.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению липолитического фермента, который может быть получен из одного из следующих родов: Streptomyces, Corynebacterium и Thermobifida по способу, включающему обработку фосфолипида так, чтобы гидролизовать жирные ацильные группы.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению липолитического фермента для биоконверсии полярных липидов для поучения ценных продуктов, где указанный липолитический фермент способен гидролизовать указанные полярные липиды, и где указанные липолитические ферменты могут быть получены из одного из следующих родов: Streptomyces, Corynebacterium и Thermobifida.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению липолитического фермента, получаемого из одного из следующих родов: Streptomyces, Corynebacterium и Thermobifida в получении пищевого продукта, где указанный липолитический фермент способен гидролизовать гликолипид и/или фосфолипид.

Аспекты настоящего изобретения представлены в формуле изобретения и в следующих пояснениях.

Другие аспекты, относящиеся к нуклеотидным последовательностям, которые можно использовать по настоящему изобретению, включают в себя: конструкцию, содержащую последовательности по настоящему изобретению; вектор, содержащий последовательности для применения по настоящему изобретению; плазмиду, содержащую последовательности для применения по настоящему изобретению; трансформированную клетку, содержащую последовательности для применения по настоящему изобретению; трансформированную ткань, содержащую последовательности для применения по настоящему изобретению; трансформированный орган, содержащий последовательности для применения по настоящему изобретению; трансформированного хозяина, содержащего последовательности для применения по настоящему изобретению; трансформированный организм, содержащий последовательности для применения по настоящему изобретению. Настоящее изобретение относится также к способам экспрессии нуклеотидной последовательности для применения по настоящему изобретению с использованием этих способов, таким как экспрессия в клетке-хозяине; включая способы переноса этой последовательности. Настоящее изобретение далее относится к способам выделения нуклеотидной последовательности, таким как выделение из клетки-хозяина.

Другие аспекты, относящиеся к аминокислотной последовательности для применения по настоящему изобретению, включают в себя: конструкцию, кодирующую аминокислотные последовательности для применения по настоящему изобретению; вектор, кодирующий аминокислотные последовательности для применения по настоящему изобретению; плазмиду, кодирующую аминокислотные последовательности для применения по настоящему изобретению; трансформированную клетку, экспрессирующую аминокислотные последовательности для применения по настоящему изобретению; трансформированную ткань, экспрессирующую аминокислотные последовательности для применения по настоящему изобретению; трансформированный орган, экспрессирующий аминокислотные последовательности для применения по настоящему изобретению; трансформированного хозяина, экспрессирующего аминокислотные последовательности для применения по настоящему изобретению; трансформированный организм, экспрессирующий аминокислотные последовательности для применения по настоящему изобретению. Настоящее изобретение относится также к способам очистки аминокислотной последовательности для применения по настоящему изобретению с использованием этих способов, таким как экспрессия в клетке-хозяине; включая способы переноса этой последовательности, и затем очистка указанной последовательности.

Для простоты цитирования, эти и другие аспекты настоящего изобретения обсуждаются сейчас под соответствующими заголовками разделов. Однако объяснения в каждом разделе не обязательно ограничены каждым конкретным разделом.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Соответственно, липолитический фермент для использования в способах и применениях по настоящему изобретению может представлять собой липолитический фермент, содержащий любую из аминокислотных последовательностей, показанных на SEQ ID No 4, 5, 7, 8, 12, 14 или 16, или аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97% или 98% идентичную им, или кодируемый любой из нуклеотидных последовательностей, показанных как SEQ ID No 3, 6, 9, 13, 15 или 17, или нуклеотидной последовательностью, по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97% или 98% идентичную им.

Предпочтительно, липолитический фермент для использования в способах и применениях по настоящему изобретению представляет собой липолитический фермент, способный гидролизовать по меньшей мере галактолипиды, и/или способный переносить ацильную группу по меньшей мере от галактолипида к одному или нескольким субстратам - акцепторам ацила, где фермент может быть получен предпочтительно из видов Streptomyces.

В одном из вариантов осуществления липолитический фермент для использования в способах и применениях по настоящему изобретению предпочтительно представляет собой липолитический фермент, способный гидролизовать по меньшей мере галактолипиды, и/или способный переносить ацильную группу по меньшей мере от галактолипида к одному или нескольким субстратам - акцепторам ацила, где фермент кодирует нуклеиновая кислота, выбранная из группы, состоящей из:

a) нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, показанную на SEQ ID No 3;

b) нуклеиновой кислоты, родственной нуклеотидной последовательности SEQ ID No 3 вследствие вырожденности генетического кода; и

c) нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, по меньшей мере на 70% идентичную нуклеотидной последовательности, показанной на SEQ ID No 3.

В одном из вариантов осуществления липолитический фермент для использования в способах и применениях по настоящему изобретению предпочтительно представляет собой липолитический фермент, содержащий аминокислотную последовательность, как показано на SEQ ID No 4, или аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 60% идентичную ей.

В другом варианте осуществления липолитический фермент для использования в способах и применениях по настоящему изобретению предпочтительно представляет собой липолитический фермент, способный гидролизовать по меньшей мере галактолипид, и/или способный переносить ацильную группу по меньшей мере от галактолипида к одному или нескольким субстратам - акцепторам ацила, где фермент содержит аминокислотную последовательность, как показано на SEQ ID No 4, или аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 60% идентичную ей.

Предпочтительно, липолитический фермент для использования в способах и применениях по настоящему изобретению представляет собой липолитический фермент, способный гидролизовать по меньшей мере галактолипиды, и/или способный переносить ацильную группу по меньшей мере от галактолипида к одному или нескольким субстратам - акцепторам ацила, где фермент может быть получен предпочтительно из видов Thermobifida, предпочтительно Thermobifida fusca.

Предпочтительно, липолитический фермент для использования в способах и применениях по настоящему изобретению представляет собой липолитический фермент, способный гидролизовать по меньшей мере галактолипиды, и/или способный переносить ацильную группу по меньшей мере от галактолипида к одному или нескольким субстратам - акцепторам ацила, где фермент может быть получен предпочтительно из видов Corynebacterium, предпочтительно Corynebacterium efficiens.

В другом варианте осуществления липолитический фермент для использования в способах и применениях по настоящему изобретению может представлять собой липолитический фермент, содержащий любую из аминокислотных последовательностей, показанных как SEQ ID No 4, 5, 7, 8, 12, 14 или 16, или аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97% или 98% идентичную им, или кодируемую одной из нуклеотидных последовательностей, показанной как SEQ ID No 3, 6, 9, 13, 15 или 17, или нуклеотидную последовательность, по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97% или 98% идентичную им.

В другом варианте осуществления липолитический фермент для использования в способах и применениях по настоящему изобретению может представлять собой липолитический фермент, содержащий любую из аминокислотных последовательностей, показанных как SEQ ID No 5, 7, 8, 14 или 16, или аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97% или 98% идентичную им, для применений, описанных здесь.

В другом варианте осуществления липолитический фермент для использования в способах и применениях по настоящему изобретению может представлять собой липолитический фермент, содержащий одну из аминокислотных последовательностей, показанных как SEQ ID No 5, 7 или 16, или аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97% или 98% идентичную им, для применений, описанных здесь.

Более предпочтительно, в одном из вариантов осуществления липолитический фермент для использования в способах и применениях по настоящему изобретению может представлять собой липолитический фермент, содержащий аминокислотную последовательность, показанную как SEQ ID No 16, или аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97% или 98% идентичную ей.

В другом варианте осуществления липолитический фермент для использования в способах и применениях по настоящему изобретению может представлять собой липолитический фермент, содержащий аминокислотную последовательность, показанную как SEQ ID No 12 или 14, или аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97% или 98% идентичную ей.

В другом варианте осуществления липолитический фермент для использования в способах и применениях по настоящему изобретению может представлять собой липолитический фермент, содержащий аминокислотную последовательность, показанную как SEQ ID No 8, или аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97% или 98% идентичную им.

В одном из вариантов осуществления липолитический фермент для использования в способах и применениях по настоящему изобретению может представлять собой липолитический фермент, способный гидролизовать по меньшей мере галактолипиды, и/или способный переносить ацильную группу по меньшей мере от галактолипида к одному или нескольким субстратам - акцепторам ацила, где фермент кодирует нуклеиновая кислота, выбранная из группы, состоящей из:

a) нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, показанную на SEQ ID No 3;

b) нуклеиновой кислоты, родственной нуклеотидной последовательности SEQ ID No 3 вследствие вырожденности генетического кода; и

c) нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, по меньшей мере на 70% идентичную нуклеотидной последовательности, показанной на SEQ ID No 3.

В одном из вариантов осуществления липолитический фермент по настоящему изобретению может представлять собой липолитический фермент, который может быть получен предпочтительно из штаммов Streptomyces Ll30 или Ll31, депонированных Danisco A/S of Langebrogade 1, DK-1001 Copenhagen K, Denmark в рамках Будапештского договора о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры в Национальной коллекции промышленных, пищевых и морских бактерий (NCIMB) 23 St Machar Street, Aberdeen Scotland, GB 25 июня 2004 под инвентарными номерами NCIMB 41226 и NCIMB 41227, соответственно.

Предпочтительно, липолитический фермент по настоящему изобретению действует по меньшей мере на гликолипид, такой как, например, дигалактозилдиглицерид (DGDG). Соответственно, липолитический фермент по настоящему изобретению может действовать также на один или несколько полярных липидных субстратов, таких как фосфолипид, например лецитин, например, фосфатидилхолин.

Альтернативным способом выражения используемого здесь термина «способный гидролизовать гликолипиды», можно сказать, что липолитический фермент обладает гидролизующей гликолипид активностью.

Предпочтительно, липолитический фермент по настоящему изобретению гидролизует гликолипид, такой как, например, дигалактозилдиглицерид (DGDG), а также фосфолипид, такой как лецитин, например, фосфатидилхолин.

Предпочтительно липолитический фермент по настоящему изобретению действует на гликолипиды, такие как DGDG или MGDG.

В одном из аспектов липолитический фермент по настоящему изобретению гидролизует DGDG до DGMG и/или MGDG до MGMG.

В одном из аспектов липолитический фермент по настоящему изобретению гидролизует лецитин до лизолецитина.

В случае когда липолитический фермент способен переносить ацильную группу по меньшей мере от гликолипида к донорному субстрату, полярный липидный субстрат можно обозначить здесь как «липидный ацильный донор».

В одном из вариантов осуществления фермент по настоящему изобретению, обладающий как фосфолипазной, так и/или гликолипазной активностью (обычно классифицируемым как E.C. 3.1.1.26; E.C. 3.1.1.4 или E.C. 3.1.1.32 согласно рекомендациям по номенклатуре ферментов (1992) Номенклатурного Комитета Международного союза по биохимии и молекулярной биологии), обладает также ацилтрансферазной активностью (обычно классифицируемой как E.C. 2.3.1.x), в соответствии с чем фермент способен переносить ацильную группу от липидного ацильного донора к одному или нескольким акцепторным субстратам, таким как один или несколько из следующих: стерин; станол; углеводород; белок; субъединица белка; глицерин.

Липид-ацилтрансферазы и их применения объясняют в находящейся в одновременном рассмотрении международной патентной заявке номер PCT/IB2004/000655. Этот документ приведен здесь в качестве ссылки. Однако липолитические ферменты из рода Streptomyces по настоящему изобретению не указаны в PCT/IB2004/000655.

В некоторых аспектах липолитический фермент для использования в способах и/или применениях по настоящему изобретению могут быть способными переносить ацильную группу от полярного липида (как определено здесь) к одному или нескольким из следующих субстратов - акцепторов ацила: стерину, станолу, углеводороду, белку или его субъединицам или глицерину.

В некоторых аспектах «акцептором ацила» по настоящему изобретению может быть любое соединение, содержащее гидроксигруппу (-OH), такое как, например, поливалентные спирты, включая глицерин; стерин; станолы; углеводороды; оксикислоты, включая фруктовые кислоты, лимонная кислота, винная кислота, молочная кислота и аскорбиновая кислота; белки или их субъединицы, такие как аминокислоты, гидролизаты белка и пептиды (частично гидролизованный белок); и их смеси и производные.

В некоторых аспектах «акцептор ацила» по настоящему изобретению может предпочтительно не являться водой.

В одном из вариантов осуществления акцептор ацила предпочтительно не является моноглицеридом и/или диглицеридом.

В одном из аспектов фермент предпочтительно способен переносить ацильную группу от липида к стерину и/или к станолу.

В одном из аспектов фермент предпочтительно способен переносить ацильную группу от липида к углеводороду.

В одном из аспектов фермент предпочтительно способен переносить ацильную группу от липида к белку или к его субъединице. Соответственно, субъединица белка может представлять собой одно или несколько из следующего: аминокислота, гидролизат белка, пептид, дипептид, олигопептид, полипептид.

Соответственно, в белке или субъединице белка акцептором ацила может быть одно или несколько из следующих составляющих белка или субъединицы белка: серин, треонин, тирозин или цистеин.

Когда субъединица белка представляет собой аминокислоту, соответственно, аминокислотой может быть любая подходящая аминокислота. Соответственно, аминокислота может представлять собой одну или несколько аминокислот из числа, например, серина, треонина, тирозина или цистеина.

В одном из аспектов фермент предпочтительно способен переносить ацильную группу от липида к глицерину.

В одном из аспектов фермент предпочтительно способен переносить ацильную группу от липида к оксикислоте.

В одном из аспектов фермент предпочтительно способен переносить ацильную группу от липида к поливалентному спирту.

В одном из аспектов липолитический фермент может как являться способным переносить ацильную группу от липида к стерину и/или станолу, так и являться способным переносить ацильную группу от липида к одному или нескольким из следующего: углеводород, белок, субъединица белка, глицерин.

Термин “лецитин”, в рамках изобретения, означает фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилинозитол, фосфатидилсерин и фосфатидилглицерин.

Для некоторых аспектов, липидный субстрат предпочтительно представляет собой по меньшей мере гликолипид, такой как, например, DGDG.

Для некоторых аспектов, липидный субстрат предпочтительно также может представлять собой фосфолипид, такой как лецитин, например фосфатидилхолин. Другие фосфолипидные субстраты по настоящему изобретению могут представлять собой один или несколько из N-ацил-фосфатидилэтаноламина (APE) или N-ацил-лизофосфатидилэтаноламина (ALPE).

Предпочтительно липидный субстрат представляет собой пищевой липид, то есть липидный компонент пищевого продукта.

Для некоторых аспектов, липолитический фермент по настоящему изобретению предпочтительно неспособен, или в основном не способен действовать на триглицерид и/или 1-моноглицерид и/или 2-моноглицерид.

В одном из вариантов осуществления липолитический фермент по настоящему изобретению не обладает активностью или не обладает существенной активностью в отношении триглицерида и/или 1-моноглицеридов, и/или 2-моноглицеридов.

Соответственно, липидный субстрат или липидный ацильный донор может представлять собой один или несколько липидов, присутствующих в одном или нескольких из следующих субстратов: жиры, включая сало, жир и молочный жир; масла, включая масла, выделенные из или производные от пальмового масла, подсолнечного масла, соевого масла, сафлорового масла, хлопкового масла, масла земляного ореха, кукурузного масла, оливкового масла, арахисового масла, кокосового масла и рапсового масла. Лецитин из сои, рапсового семени или яичного желтка также представляет собой подходящий липидный субстрат. Липидный субстрат может представлять собой липид овса или материал на основе другого растения, содержащий галактолипиды.

В одном из аспектов липидный субстрат или липидный ацильный донор предпочтительно представляет собой лецитин (такой как фосфатидилхолин) яичного желтка.

Для некоторых аспектов по настоящему изобретению липиды можно выбирать из липидов с цепью жирной кислоты длиной от 8 до 22 атомов углерода.

Для некоторых аспектов по настоящему изобретению липид можно выбирать из липидов с длиной цепи жирной кислоты от 16 до 22 атомов углерода, более предпочтительно от 16 до 20 атомов углерода.

Для некоторых аспектов по настоящему изобретению липид можно выбирать из липидов с длиной цепи жирной кислоты не более чем 14 атомов углерода, соответственно из липидов с длиной цепи жирной кислоты от 4 до 14 атомов углерода, соответственно от 4 до 10 атомов углерода, соответственно от 4 до 8 атомов углерода.

Соответственно, липолитический фермент по настоящему изобретению демонстрирует по меньшей мере гликолипазную активность (E.C. 3.1.1.26). Соответственно, липолитический фермент по настоящему изобретению может также демонстрировать активность фосфолипазы A2 (E.C. 3.1.1.4) и/или активность фосфолипазы A1 (E.C. 3.1.1.32).

Для некоторых аспектов липолитический фермент по настоящему изобретению может обладать только гликолипазной активностью (E.C. 3.1.1.26).

Для некоторых аспектов липолитический фермент по настоящему изобретению представляет собой галактолипазу (E.C. 3.1.1.26). Однако тот факт, что фермент определяют как галактолипазу, не мешает ему обладать другими побочными активностями, такими как, например, активность в отношении других полярных липидов.

В рамках изобретения термины «гликолипазная активность» и «галактолипазная активность» используют взаимозаменяемо.

Соответственно, для некоторых аспектов липолитический фермент по настоящему изобретению может быть способным переносить ацильную группу от гликолипида и/или фосфолипида к одному или нескольким акцепторным субстратам.

Соответственно, акцепторный субстрат может представлять собой один или несколько из следующих субстратов: стерин, станол, углеводород, белок, глицерин.

Термин «полярные липиды» в рамках изобретения означает фосфолипиды и/или гликолипиды. В некоторых аспектах термин полярные липиды предпочтительно обозначает по меньшей мере гликолипиды.

Гликолипазную активность; фосфолипазную активность и/или триацилглицеринлипазную активность фермента можно определить с применением анализов, представленных ниже.

Определение галактолипазной активности (анализ гликолипазной активности (GLU-7)):

Субстрат

0,6% дигалактозилдиглицерид (Sigma D 4651), 0,4% Тритон-X 100 (Sigma X-100) и 5 мМ CaCl₂ растворяли в буфере 0,05 М HEPES pH 7.

Процедура анализа:

400 мкл субстрата добавляли в 1,5 мл пробирку Эппендорф и помещали в термосмеситель Эппендорф при 37°C на 5 минут. Во время t=0 мин добавляли 50 мкл раствора фермента. Также анализировали контроль с водой вместо фермента. Образец перемешивали при 10×100 об/мин в термосмесителе Эппендорф при 37°C в течение 10 минут. Во время t=10 мин пробирку Эппендорф помещали в другой термосмеситель при 99°C на 10 минут, чтобы остановить реакцию.

Свободную жирную кислоту в образцах анализировали с применением набора NEFA C от WAKO GmbH.

Ферментати