Вариантные фитазные ферменты

Вариантные фитазные ферменты

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к фитазам, нуклеотидным последовательностям для них, способам продуцирования фитаз и их применению.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к области ферментов в качестве добавок к кормам. Более конкретно, настоящее изобретение относится к фитазам, которые могут быть использованы для усиления усвоения фосфата в продуктах питания и кормах для животных.

Предшествущий уровень техники и известный уровень техники

Фитат представляет собой основную форму запасания фосфора в зерновых злаках и бобовых растениях. Однако моногастрические животные (животные с однокамерным желудком), такие как свинья, домашняя птица и рыба, не способны метаболизировать или абсорбировать фитат (или фитиновую кислоту) и поэтому он экскретируется, приводя к загрязнению фосфором в областях интенсивного животноводства. Кроме того, фитиновая кислота также действует как антидиетологический агент у моногастрических животных посредством хелатирования металлических агентов, таких как кальций, медь и цинк.

Для того чтобы обеспечить достаточно фосфатов для роста и здорового состояния этих животных, неорганический фосфат добавляют в их рационы. Такое добавление может быть дорогостоящим и дополнительно усиливает проблемы загрязнения.

В результате действия фитазы фитат обычно гидролизуется, производя низшие инозитфосфаты и неорганический фосфат. Фитазы используют в качестве добавок к кормам для животных, где они улучшают доступность органического фосфора у животных и снижают загрязнение фосфатом окружающей среды (Wodzinski RJ, Ullah AH. Adv Appl Microbiol. 42, 263-302 (1996)).

Ряд фитаз грибного (Wyss M. с сотр. Appl. Environ. Microbiol. 65 (2), 367-373 (1999); Berka R.M. с сотр. Appl. Environ. Microbiol. 64 (11), 4423-4427 (1998); Lassen S. с сотр. Appl. Environ. Microbiol. 67 (10), 4701-4707 (2001)) и бактериального происхождения (Greiner R. с сотр. Arch. Biochem. Biophys. 303 (1), 107-113 (1993); Kerovuo с сотр. Appl. Environ. Microbiol. 64 (6), 2079-2085 (1998); Kim H.W. с сотр. Biotechnol. Lett. 25, 1231-1234 (2003); Greiner R. с сотр. Arch. Biochem. Biophys. 341 (2), 201-206 (1997); Yoon S.J. с сотр. Enzyme and microbial technol. 18, 449-454 (1996); Zinin N.V. с сотр. FEMS Microbiol. Lett. 236, 283-290 (2004))) были описаны в литературе.

Однако в настоящее время ни одна из этих фитаз не проявляет свойства, необходимые для эффективного применения в качестве добавки к корму для животных. В частности, грибные фитазы проявляют тенденцию к протеолитической нестабильности (Igbasan F.A. с сотр. Arch. Anim. Nutr. 53,353-373 (2000)) и поэтому чувствительны к расщеплению, в то время как большинство бактериальных фитаз имеет узкую субстратную специфичность для одного фитата и слабо расщепляет инозитфосфаты промежуточных стадий фосфорилирования (Greiner R. с сотр., Arch. Biochem. Biophys. 303 (1), 107-113 (1993); Kerovuo J с сотр. Biochem. J. 352, 623-628 (2000)).

Следовательно, существует необходимость улучшения фитаз.

Сущность изобретения

В широком аспекте настоящее изобретение относится к фитазам, полученным из бактерии и ее модифицированным формам. В частности, изобретение относится к фитазам, полученным из бактерии Buttiauxella sp. и ее вариантным/модифицированным формам, выбранным и/или сконструированным для улучшения характеристик по сравнению с ферментом дикого типа (исходным).

Настоящее изобретение является выгодным, так как оно предоставляет новые фитазы, которые обладают свойствами, делающими их практически полезными и эффективыми в качестве кормовых ферментов. В частности, изобретение относится к выделенным и/или очищенным новым фитазным полипептидам, как описано в данном описании, или к их функциональному фрагменту, или вариантам, или их модифицированным формам. Изобретение также предоставляет последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую указанную фитазу.

Чтобы быть эффективной в качестве ферментной добавки к продукту питания или корму для животных, в фитазе должен быть скомбинирован ряд различных свойств. Для того чтобы быть в состоянии расщепить фитиновую кислоту в кислой окружающей среде желудка животных, она должна быть активной при низком pH, предпочтительно в сверхшироком диапазоне значений pH. Кроме того, она должна иметь высокую специфическую активность и предпочтительно высокую термостабильность, чтобы обеспечить возможность белку выдержать высокие температуры, обычно применяемые для приготовления кормов, таких как кормовые гранулы.

Также важно, что фермент обладает широкой субстратной специфичностью, позволяющей ему гидролизовать не только фитат, но также промежуточные продукты расщепления фитата, такие как инозитпентафосфаты, -тетрафосфаты и

-трифосфаты. Исследования расщепления фитата у свиней показывают, что эти инозитолигофосфаты в противном случае остаются главным образом нерастворимыми в тонкой и толстой кишке и, таким образом, недоступны для щелочных фосфатаз, продуцируемых животным и микрофлорой кишечника (Schlemmer U. с сотр. Arch. Anim. Nutr. 55, 255-280 (2001)). Были идентифицированы вариации профилей субстратной специфичности различных ферментов. Например, инозиттрифосфаты, генерируемые фитазой B. subtilis, в основном, устойчивы к дальнейшему гидролизу посредством этого фермента [Kerovuo J. с сотр. Biochem J. 352, 623-628 (2000)].

В другом аспекте изобретения предоставляется плазмида или векторная система, или трансформированный или трансгенный организм, включающий новую фитазу, как описано в данном описании, или ее модифицированную форму.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к трансгенным организмам, модифицированным для экспрессии новой фитазы, как описано в данном описании, или ее модифицированной формы и поэтому способным продуцировать фитазу. Настоящее изобретение дополнительно предоставляет средства и способы биотехнологического продуцирования фитаз и их применения в качестве комовых добавок.

Аспекты настоящего изобретения представлены в формуле изобретения и в нижеследующем комментарии.

Для облегчения ориентирования эти и другие аспекты по настоящему изобретению теперь обсуждаются в разделах с соответствующими заголовками. Однако идеи каждого раздела не обязательно ограничены каждым отдельным разделом.

Как использовано в отношении настоящего изобретения, термины «продуцировать или получать», «продуцирующий», «продуцированный или полученный», «способный продуцировать», «продуцирование или получение» являются синонимичными по отношению к терминам «готовить», «приготовление», «приготовленный», «подготовка», «генерированный», «генерирование» и «способный приготавливать».

Как использовано в отношении настоящего изобретения, термины «экспрессия», «экспрессировать», «экспрессированный» и «способный экспрессироваться» являются синонимичными по отношению к терминам «транскрипция», «транскрибировать» и «способный транскрибироваться».

Как использовано в отношении настоящего изобретения, термины «трансформация» и «трансфекция» относятся к способу введения последовательностей нуклеиновой кислоты в хозяев, клетки-хозяева, ткани или органы.

Другие аспекты, имеющие отношение к нуклеотидным последовательностям, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, включают: конструкцию, включающую последовательности по настоящему изобретению; вектор, включающий последовательности для применения в настоящем изобретении; плазмиду, включающую последовательности для применения в настоящем изобретении; трансформированную клетку, включающую последовательности для применения в настоящем изобретении; трансформированную ткань, включающую последовательности для применения в настоящем изобретении; трансформированный орган, включающий последовательности для применения в настоящем изобретении; трансформированного хозяина, включающего последовательности для применения в настоящем изобретении; трансформированный организм, включающий последовательности для применения в настоящем изобретении. Настоящее изобретение также осуществляет способы экспрессии нуклеотидной последовательности для применения в настоящем изобретении с использованием упомянутой выше, такие как экспрессия в клетке-хозяине; включая способы переноса вышеупомянутой. Настоящее изобретение дополнительно осуществляет способы выделения нуклеотидной последовательности, такой как выделение из клетки-хозяина.

Другие аспекты, имеющие отношение к аминокислотным последовательностям для применения в настоящем изобретении, включают: конструкцию, кодирующую аминокислотные последовательности для применения в настоящем изобретении; вектор, кодирующий аминокислотные последовательности для применения в настоящем изобретении; плазмиду, кодирующую аминокислотные последовательности для применения в настоящем изобретении; трансформированную клетку, экспрессирующую аминокислотные последовательности для применения в настоящем изобретении; трансформированную ткань, экспрессирующую аминокислотные последовательности для применения в настоящем изобретении; трансформированный орган, экспрессирующий аминокислотные последовательности для применения в настоящем изобретении; трансформированного хозяина, экспрессирующего аминокислотные последовательности для применения в настоящем изобретении; трансформированный организм, экспрессирующий аминокислотные последовательности для применения в настоящем изобретении. Настоящее изобретение также осуществляет способы очистки аминокислотной последовательности для применения в настоящем изобретении с использованием вышеупомянутой, такие как экспрессия в клетке-хозяине; включая способы переноса вышеупомянутых и затем очистку указанной последовательности.

Краткое описание чертежей

Фигура 1 показывает SDS PAGE анализ (электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия) рекомбинантной фитазы Buttiauxella P1-29, очищенной с помощью хроматографии с DEAE-сефарозой. Фигура демонстрирует сканирование следа цифрового фотографического изображения полосы, содержащей образец фитазы Buttiauxella.

Фигура 2 показывает профиль pH фитазы Buttiauxella P1-29.

Фигура 3 показывает субстратную специфичность очищенной рекомбинантной фитазы Buttiauxella P1-29 с фракциями инозитфосфата различной степени фосфорилирования и модельных субстратов. Сокращения: IP6 - фитиновая кислота, IP5, IP4 и IP3 - смеси изомерных инозитпента-, тетра- и трифосфатов соответственно. Fru P2 - фруктозо-1,6-дифосфат, Fru P1 - фруктозо-6-фосфат.

SEQ ID NO:1 приводит последовательность, полученную для идентификации бактериального штамма.

SEQ ID NO:2 приводит полинуклеотидную последовательность, включающую фитазный ген Buttiauxella P1-29.

SEQ ID NO:3 приводит аминокислотную последовательность фитазного гена Buttiauxella P1-29.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение предоставляет фермент, включающий аминокислотную последовательность, соответствующую фитазе Buttiauxella sp. или ее модифицированной форме, гомологу, варианту, функциональному эквиваленту или эффективному фрагменту.

Термин «фитаза» означает белок или полипептид, который способен катализировать гидролиз сложных эфиров фосфорной кислоты, включая фитат, и высвобождать неорганический фосфат. Некоторые фитазы в дополнение к фитату способны гидролизовать, по меньшей мере, некоторые инозитфосфаты промежуточных стадий фосфорилирования.

Термин «соответствующий фитазе Buttiauxella sp.» означает, что фермент не был получен из источника Buttiauxella sp. Зато фермент предпочтительно должен иметь те же самые функциональные характеристики или последовательность как у фитазы Buttiauxella sp. Например, Фитаза Buttiauxella sp. может быть вариантом, полученным из Buttiauxella sp., но который не присутствует в природных видах Buttiauxella.

Buttiauxella spp. включает Buttiauxella agrestis, Buttiauxella brennerae, Buttiauxella ferragutiae, Buttiauxella gaviniae, Buttiauxella izardii, Buttiauxella noackiae, Buttiauxella warmboldiae. Штаммы видов Buttiauxella доступны в DSMZ, Германском национальном центре ресурсов биологического материала. Фитазы предпочтительно идентифицируют из Buttiauxella spp. с помощью способов, описанных в данном описании, например, гибридизацией с SEQ ID No 2. Предпочтительные штаммы Buttiauxella spp. для выделения полипептидов и/или полинуклеотидов перечислены в примерах.

Термины «фитаза дикого типа» или «дикий тип» в соответствии с изобретением описывают фитазный фермент с аминокислотной последовательностью, обнаруженной в природе.

Термины «вариант фитазного фермента», «фитазный вариант» или «вариант» в соответствии с изобретением описывают фитазный фермент с аминокислотной последовательностью, полученной из аминокислотной последовательности исходной фитазы, но отличающийся одной или несколькими аминокислотными замещениями, инсерциями и/или делециями, которые вместе упоминаются как «мутации». Предусматривается, что вариант фитазного фермента также может быть исходным фитазным ферментом для дальнейших раундов способов получения фитазных вариантов, таких как молекулярная эволюция.

Термин «гомологичный полипептид(ы)» в соответствии с настоящим изобретением, описаный также как «гомологи» в данном описании, описывает полипептиды, предпочтительно фитазные ферменты (то есть «гомологичные фитазы» или «гомологичные ферменты») с последовательностью, идентичной более чем на 75% по сравнению с первой аминокислотной последовательностью полипептидов/фитаз/ферментов, которая предпочтительно имеет, по меньшей мере, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% гомологии последовательности.

Термин «его функциональный эквивалент» означает, что фермент должен иметь примерно такие же функциональные характеристики, что и фитаза Buttiauxella sp. Термин «модифицированная форма» или «вариант» означает, что фермент был модифицирован относительно своей исходной формы, но сохранил такие же ферментативные функциональные характеристики, что и фитаза Buttiauxella sp. В частности, термины «вариант» или «модифицированная форма» включают фитазные ферменты с аминокислотной последовательностью, полученной из аминокислотной последовательности фитазы исходного/дикого типа и имеющей одно или несколько аминокислотных замещений, инсерций и/или делеций, которые вместе упоминаются как мутации. Модифицированные формы или варианты могут проявлять измененные ферментативные характеристики по сравнению с исходным ферментом. Предпочтительно, модифицированные формы или варианты имеют один или несколько следующих улучшенных фенотипов: повышенная термостабильность и/или; повышенная протеолитическая (например, пепсиновая) стабильность и/или; повышенная специфическая активность и/или; более широкая субстратная специфичность и/или; активность в сверхшироком диапазоне pH. Термин «функциональный» или «эффективный» фрагмент означает фрагмент или часть фитазы Buttiauxella sp., которая сохраняет примерно сходную ферментативную функцию или эффект.

Предпочтительно фитазный фермент данного аспекта по изобретению имеет такую же последовательность или последовательность, которая, по меньшей мере, на 75% идентична (гомологична) таковой фитазы Buttiauxella sp.

Соответственно фермент, включает аминокислотную последовательность как показано в SEQ ID NO:3, или последовательность, имеющую, по меньшей мере, 75% идентичности (гомологии) с таковой или ее функциональный фрагмент. В предпочтительном варианте осуществления изобретение предоставляет выделенный и/или очищенный полипептид, имеющий аминокислотную последовательность как представлено в SEQ ID NO:3, или последовательность, имеющую, по меньшей мере, 75% идентичности (гомологии) с таковой или ее функциональный фрагмент. При ссылке на SEQ ID No.3 и полипептиды, включающие SEQ ID No.3, предусмотрено, что это также относится к полипептидам, которые ко- или посттрансляционно процессируются во время экспрессии, например, путем отщепления сигнального пептида. Посттрансляционное отщепление может также происходить по C-концу. Поэтому в предпочтительном варианте осуществления его эффективный фрагмент (также упоминаемый как его функциональный фрагмент) представляет собой зрелый полипептид, продуцированный с помощью нативного хозяина или приемлемого соответствующего экспрессионного хозяина.

В другом варианте осуществления фитаза характеризуется тем, что она получена из штамма P1-29 Buttiauxella sp., депонированного под инвентарным номером NCIMB 41248.

В предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к фитазе в соответствии с любым вариантом осуществления первого аспекта по изобретению, которая включает одну или несколько мутаций в следующих положениях (нумерация соответствует нумерации в SEQ ID No. 3): 59, 70, 122, 125, 167, 193, 197, 204, 209, 211, 221, 223, 225, 240, 242, 244, 268, 281, 289, 294, 303, 336, 351.

Эти положения характеризуются тем, что мутагенез фермента в этих положениях ведет к улучшению желаемых ферментативных характеристик.

Следующие замещения могут быть предпочтительными вариантами:

Под «консервативными мутациями» понимают мутации аминокислотных остатков, которые являются консервативными на основе аминокислотных характеристик, по сравнению с указанными аминокислотными остатками. Аминокислотные характеристики включают размер остатка, гидрофобность, полярность, заряд, значение pK и другие аминокислотные характеристики, известные в данной области. Предпочтительные консервативные мутации перечислены ниже как консервативные замещения.

В особенно предпочтительном варианте осуществления мутациями являются одно или несколько из следующих положений: K59; T167; K240; T167; K240; D244; Q289; T209 и F197.

Предпочтительные мутации в этих специфических положениях перечислены выше, более предпочтительные мутации включают: K59E; T167V; K240T; T167I; K240E; D244C; Q289Y; T209K и F197S.

В дальнейшем предпочтительном варианте осуществления предоставляется фитаза, включающая комбинацию мутаций, выбранных из группы, состоящей из:

D125E/H193R;

A294E/N303K;

T167I/K240T;

D223E/K240E/N351D;

T167I/K240T/A294E/N303K;

T167I/K240E/A242S/A294E/N303K;

A122T/T167I/F197S/T209K/A211P/K240E/A294E/N303K;

A122T/T167I/F197S/T209K/A211P/K240E/A242S/S281L/Q289Y/A294E/N303K;

A122T/D125E/H193R/F197S/T209K/A211P/S221N/G225A/K240E/A294E/ N303K;

D125E/T167I/H193R/F197S/T204I/T209K/A211P/K240E/A268V/Q289H/A294E/N303K;

A122T/T167I/H193R/F197S/T204I/T209K/A211P/K240E/A268V/Q289H/A294E/N303K/I336F и

N70Y/D125E/T167I/H193R/F197S/T204I/T209K/A211P/K240E/A268V/

Q289H/A294E/N303K.

Таким образом, предпочтительная фитаза в соответствии с настоящим изобретением представляет собой вариант, включающий аминокислотную последовательность, показанную как SEQ ID NO:3 или ее эффективный фрагмент (или ее гомолог, предпочтительно фитаза характеризуется тем, что она получена из штамма P1-29 Buttiauxella sp., депонированного под инвентарным номером NCIMB 41248, или его гомолога), за исключением имеющих одну или несколько аминокислотных мутаций, перечисленных выше, или одну из комбинаций мутаций, перечисленных выше.

В этих вариантах осуществления номенлатура обозначает фитазу, включающую аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:3 с мутациями, обозначенными путем ссылки на положения аминокислот в SEQ ID NO:3. Номенклатура описано более детально ниже.

Соответственно эти варианты показывают улучшенные характеристики по отношению к любой одной из следующих: температурная стабильность, диапазон pH, стабильность к пепсину, специфическая активность, субстратная специфичность и расширенная субстратная специфичность. Приемлемые способы определения этих характеристик раскрыты в данном описании.

В частности, улучшение фитазных характеристик направлено на ферментативную стабильность в условиях питания и обработки корма, ферментативную стабильность в процессе прохождения через желудок и ферментативную активность и стабильность в желудке человека или животных и/или кишечнике с получением улучшенных вариантов, особенно приемлемых для применения в качестве кормовых добавок. Таким образом, такие улучшения включают среди других параметров увеличение стабильности при повышенных температурах, предпочтительно при температурах выше 65°C, увеличение стабильности против протеолитического расщепления, предпочтительно протеазы пищеварительного тракта, такой как пепсин, увеличение каталитической активности при низком pH, предпочтительно каталитической активности при pH ниже 5,5, и общей эффективности высвобождения фосфатных групп из фитата и предпочтительно при добавлении инозитфосфатов.

Номенклатура

В настоящем описании и формуле изобретения используется общепринятый однобуквенный и трехбуквеный коды для аминокислотных остатков. Для облегчения ориентирования мутации в ферментативных вариантах описаны посредством использования следующей номенклатуры: аминокислотный остаток в исходном ферменте; положение; замещенный аминокислотный остаток(и). В соответствии с этой номенклатурой замещение, например, аланинового остатка на глициновый остаток в положении 20 обозначают как Ala20Gly или A20G. Делецию аланина в том же положении показывают как Ala20* или A20*. Инсерцию дополнительного аминокислотного остатка (например, глицина) показывают как Ala20AlaGly или A20AG. Делецию последовательных участков аминокислотных остатков (например, между аланином в положении 20 и глицином в положении 21) обозначают как Δ(Ala20-Gly21) или Δ(A20-G21). Когда исходная последовательность фермента содержит делецию по сравнению с последовательностью фермента, применяемой для нумерации, инсерцию в этом положении (например, аланин в делетированном положении 20) обозначают как *20Ala или *20A. Множественные мутации выделяют знаком плюс или косой чертой. Например, две мутации в положениях 20 и 21, замещающие аланин и глутаминовую кислоту на глицин и серин, соответственно, обозначают как A20G+E21S или A20G/E21S. Когда аминокислотный остаток в данном положении замещают двумя или более альтернативными аминокислотными остатками, эти остатки разделяют запятой или косой чертой. Например, замещение аланина в положении 30 на глицин или глутаминовую кислоту обозначают как A20G,E или A20G/E, или A20G, A20E. Когда положение, приемлемое для модификации, идентифицируют в данном описании без предложения о любой специфической модификации, это обусловлено тем, что любой аминокислотный остаток может быть замещен на аминокислотный остаток, представленный в положении. Так, например, когда модификация аланина в положении 20 упомянута, но не уточняется, следует понимать, что аланин может быть делетирован или замещен на любой другой аминокислотный остаток (то есть, любой один из R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V).

Соответственно фитаза или функциональный эквивалент по настоящему изобретению характеризуются тем, что указанная фитаза имеет специфическую активность, по меньшей мере, 100 U/мг или 200U/мг, предпочтительно, по меньшей мере, 300 U/мг, где указанную специфическую активность определяют путем инкубации указанной фитазы в растворе, содержащем 2 мМ фитата, 0,8 мМ CaCl₂ в 200 мМ натрий ацетатного буфера при pH 3,5; как подробно описано в Примере 1. Фитаза по настоящему изобретению или ее функциональный эквивалент также могут быть соответственно охарактеризованы тем, что указанная фитаза имеет максимальную активность при pH около 4-4,5; где указанную активность определяют путем инкубации указанной фитазы в растворе, содержащем 2 мМ фитата, 0,8 мМ CaCl₂ в 200 мМ натрий ацетатного буфера. Фитаза по настоящему изобретению также может быть соответственно охарактеризована тем, что указанная фитаза имеет 40% или более максимальную активность, наблюдаемую при pH 2,5 и 5,5; где глицин гидрохлоридный буфер применяется для определения активности при pH 2,5.

Соответственно, в одном варианте осуществления фитаза или ее функциональный эквивалент по настоящему изобретению характеризуются тем, что указанная фитаза имеет специфическую активность 330 U/мг или выше, где указанную специфическую активность определяют путем инкубации указанной фитазы в растворе, содержащем 2 мМ фитата, 0,8 мМ CaCl₂ в 200 мМ натрий ацетатного буфера при pH 3,5. В другом варианте осуществления фитаза по настоящему изобретению или ее функциональный эквивалент также могут быть соответственно охарактеризованы тем, что указанная фитаза имеет два максимума активности около pH 3 и pH 4-4,5; где указанную активность определяют путем инкубации указанной фитазы в растворе, содержащем 2 мМ фитата, 0,8 мМ CaCl₂ в 200 мМ натрий ацетатного буфера.

В другом аспекте изобретение предоставляет выделенную и/или очищенную молекулу нуклеиновой кислоты или нуклеотидную последовательность, кодирующую фермент, включающий аминокислотную последовательность, соответствующую фитазе Buttiauxella sp., или ее гомолог. Соответственно указанная выделенная и/или очищенная молекула нуклеиновой кислоты кодирует полипептид, включающий аминокислотную последовательность, как показано в SEQ ID NO:3, или последовательность, имеющую, по меньшей мере, 75% идентичности (гомологии) с таковой или ее эффективный фрагмент. В одном варианте осуществления молекула нуклеиновой кислоты кодирует полипептид, включающий SEQ ID NO:3 и включающий мутации в предпочтительных положениях, перечисленных в данном описании или любую из специфических мутаций или комбинаций мутаций, перечисленных в данном описании. В другом варианте осуществления изобретение предоставляет выделенную и/или очищенную молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую нуклеотидную последовательность, которая является такой же или комплементарной, или содержит любые приемлемые замещения кодонов для любого такового SEQ ID NO:2 или включает последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% гомологии последовательности с SEQ ID NO:2.

Еще в другом аспекте изобретение относится к нуклеотидной последовательности и к применению нуклеотидной последовательности, показанной как:

(а) нуклеотидная последовательность, представленная как SEQ ID No.2;

(b) нуклеотидная последовательность, которая является вариантом, гомологом, производным или фрагментом нуклеотидной последовательности, представленной как SEQ ID No.2;

(c) нуклеотидная последовательность, которая комплементарна нуклеотидной последовательности, представленной как SEQ ID No.2;

(d) нуклеотидная последовательность, которая комплементарна варианту, гомологу, производному или фрагменту нуклеотидной последовательности, представленной как SEQ ID No.2;

(e) нуклеотидная последовательность, которая способна гибридизироваться с нуклеотидной последовательностью, представленной как SEQ ID No.2;

(f) нуклеотидная последовательность, которая способна гибридизироваться с вариантом, гомологом, производным или фрагментом нуклеотидной последовательности, представленной как SEQ ID No.2;

(g) нуклеотидная последовательность, которая комплементарна нуклеотидной последовательности, которая способна гибридизироваться с нуклеотидной последовательностью, представленной как SEQ ID No.2;

(h) нуклеотидная последовательность, которая комплементарна нуклеотидной последовательности, которая способна гибридизироваться с вариантом, гомологом, производным или фрагментом нуклеотидной последовательности, представленной как SEQ ID No.2;

(i) нуклеотидная последовательность, которая способна гибридизироваться с комплементом нуклеотидной последовательности, представленной как SEQ ID No.2;

(j) нуклеотидная последовательность, которая способна гибридизироваться с комплементом варианта, гомолога, производного или фрагмента нуклеотидной последовательности, представленной как SEQ ID No.2.

Считается, что нуклеотид гибридизируется с одним из вышеупомянутых нуклеотидов (e), (f), (g), (h), (i) или (j), если он спосбен гибридизироваться в условиях средней жесткости, более предпочтительно высокой жесткости, даже более предпочтительно в условиях очень высокой жесткости.

Для приготовления стандартных молекулярно биологических потоколов блот-гибридизации для блоттинга может быть использован, например, Саузерн-блоттинг для гибридизации ДНК. Количество ДНК-мишени зависит от относительной избыточности последовательности-мишени. Если применяют чистую последовательность-мишень, предпочтительно содержание между 1 и 5 пикограмм ДНК на тысячу пар нуклеотидов (т.п.н.) полинуклеотидов. Обычно лимит для детекции составляет около 0,5 пг ДНК для радиоактивного зонда со специфической активностью 10⁹ dpm/мг, который эквивалентен однокопийному гену 500 п.н. длиной в 3,3 мг геномной ДНК сложного генома (например, человека). Практически будет использовано около 10 мг геномной ДНК - например, для скрининга организмов, таких как микроорганизмы, которые содержат кодирующий фитазу полинуклеотид изобретения. Если ДНК-мишенью является бактериальная или, например, плазмидная, она будет разбавлена ДНК соответственно для избежания избыточной экспозиции. ДНК-мишень подвергают блоттингу, например, посредством дот-блоттинга или посредством блоттинга электрофорезного геля. Предпочтительные условия описаны в «Membrane Transfer and Detection Methods, Amersham International plc, UK.- PI/162/85/1». Предпочтительно использование связывающей N+ положительно заряженной нейлоновой мембраны (Amersham Life Science). Зонд предпочтительно готовят согласно Pharmacia's 'Ready to Go DNA^TM меченому набору для приготовления зонда > 1×10⁹ dpm/микрограмм. Зонд используют в гибридизационном буфере в концентрации 1×10⁶ dpm на миллилитр гибридизационного буфера. Блоты предпочтительно прегибридизируют в гибридизационном буфере (6×SSC, 5 × раствор Денхардта и 0,5% SDS, и ДНК денатурированной спермы лосося в 100 мг/мл буфера) один час при 65°C с последующей гибридизацией в гибридизационном буфере, содержащем денатурированный меченый зонд, со встряхиванием в течение 12 часов при 65°C. Блот(ы) затем промывают в соответствующем объеме промывочного буфера (обычно 50 мл) в 2×SSC, 0,1% SDS в течение 30 минут при 65°C, затем следует вторая промывка в приемлемом объеме промывочного буфера (обычно 50 мл) в любом аналогичном промывочном буфере (2×SSC, 0,1% SDS) для промывки средней жесткости или 0,1% × SSC, 0,1% SDS в течение 10 минут при 65°C (высокая жесткость), вторая промывка может быть повторена при 70°C для промывки в условиях очень высокой жесткости.

Нуклеотидная последовательность по настоящему изобретению может включать последовательности, которые кодируют SEQ ID No.3 или его эффективный фрагмент, или вариант, модифицированную форму, гомолог или его производное.

В частности, изобретение предоставляет плазмиду или векторную систему, включающую фитазу, как описано в данном описании, или ее гомолог или производное. Предпочтительно плазмида или векторная система включают последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID No:2, или последовательность, которая, по меньшей мере, на 75% гомологична таковой или ее эффективный фрагмент. Соответственно плазмида или векторная система представляют собой экспрессионный вектор для экспрессии любого фермента, кодируемого последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной в любом SEQ ID No:2 или последовательностью, которая, по меньшей мере, на 75% гомологична (идентична) таковой микроорганизма. Приемлемые экспрессионные векторы описаны в данном описании. Кроме того, изобретение предоставляет плазмиду или векторную систему для экспрессии любых модифицированных ферментов или вариантов, или функциональных фрагментов, описанных в данном описании. Приемлемые экспрессионные векторы описаны в данном описании.

Фитазные варианты

Настоящее изобретение заключается в улучшении характеристик исходной фитазы путем модификации одного или нескольких аминокислотных остатков аминокислотной последовательности исходной фитазы.

Фитазные ферменты, применяемые в качестве исходных ферментов в соответствии с настоящим изобретением, включают фитазы дикого типа бактерий, в частности предпочтительно фитазы, доступные из или полученные из Buttiauxella sp., имеющей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID No.3, или ее эффективный фрагмент, или аминокислотную последовательность, идентичную SEQ ID No.3 более чем на 75%, предпочтительно более чем на 80%, более предпочтительно более чем на 90%, даже более предпочтительно более чем на 95%, 96%, 97%, 98%, предпочтительно более чем на 99% (то есть гомологичный полипептид), или его эффективный фрагмент.

Улучшенные варианты фитазного фермента по изобретению предпочтительно обладают идентичностью, по отношению к Seq ID No.3 или ее эффективному фрагменту более чем на 75%, предпочтительно более чем на 80%, более предпочтительно более чем на 90%, более предпочтительно более чем на 95%, 96%, 97%, 98%, предпочтительно более чем на 99%. Однако также предусмотрено, что варианты могут быть гетерологичными (то есть, негомологичными) по отношению к SEQ ID No.3. Например, варианты, продуцированные с помощью рекомбинантной технологии, такой как экзо-опосредованная рекомбинация, или семейственная перестановка, могут приводить к вариантам, хотя и приготовленным с использованием исходной фитазы в соответствии с настоящим изобретением, которые могут иметь менее чем 75% гомологию.

Выравнивание последовательностей, а также определение идентичности последовательностей соответственно может быть выполнено посредством компьютерных программ, известных в данной области, таких как GAP, обеспеченной пакетом программ GCG (Needleman, S.B. и Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, p.443-453). GAP может быть использована со следующими установочными параметрами для сравнения полипептидной последовательности: GAP создание штрафной санкции 3,0 и GAP расширение штрафной санкции 0,1. Выравнивание последовательностей применяют, например, для определения соответствующих положений в гомологичных полипептидах.

Фитазные ферменты были охарактеризованы после гетерологичной экспрессии в одном или нескольких следующих экспрессионных хозяевах: Escherichia coli K12; Bacillus subtilis; Saccharomyces cerevisiae. Могут быть использованы другие экспрессионные хозяева.

Улучшение фитазных характеристик в соответствии с настоящим изобретением направлено на применение для обработки продуктов питания и корма, а также для применения в качестве добавки к продуктам питания и кормам. В частности, улучшение направлено на стабильность в условиях обработки продуктов питания и корма, стабильность в процессе прохождения через желудок и активность и стабильность в желудке человека или животных, и/или кишечнике. Такие улучшения включают среди других параметров увеличение стабильности при повышенных температурах, предпочтительно при температуре выше 65°C, увеличение стабильности против протеолитического расщепления, предпочтительно протеазы пищеварительного тракта, увеличение каталитической активности при низком pH, предпочтительно каталитической активности при pH ниже 5,5; и общей эффективности высвобождения фосфатных групп из фитата.

Увеличение стабильности при повышенных температурах определяют количественно с помощью температуры инактивации фермента. Температуру инактивации определяют как температуру, при которой остаточная активность фитазного фермента после инкубации определенной продолжительности и последующего охлаждения до комнатной температуры составляет 50% остаточной активности такого же фитазного фермента, инкубированного с той же продолжительностью в тех же условиях при комнатной температуре. Различия в термостабильности представляют собой различия в °C между температурами инактивации двух ферментов.

Положения и/или области, которые должны быть мутированы для получения улучшенных характеристик были найдены путем анализа последовательности и структуры фитаз дикого типа, а также путем мутагенеза исходных ферментов, в частности, путем введения мутаций в аминокислотную последовательность дикого типа, представленную в SEQ ID No.3, и скрининга ферментативных вариантов с улучшенными характеристиками. Поэтому были идентифицированы определенные области, а также положения исходных ферментов, которые существенны для улучшения характеристик фитазных ферментов.

Поэтому изобретение относится к фитазным вариантам с улучшенными характеристиками, которые по сравнению с исходной фитазой включают мутации в одном или нескольких из следующих положений (пронумерованных в соответствии с нумерацией в SEQ ID No.3): 59, 70, 122, 125, 167, 193, 197, 204, 209, 211, 221, 223, 225, 240, 242, 244, 268, 281, 289, 294, 303, 336, 351 и/или в соответствующих положениях фитазных гомологов по отношению к фитазе, как показано в аминокислотной последовательности Seq ID No.3. Эти положения характеризуются тем, что мутагенез в этих положениях приводит к улучшению характеристик фермента.