Экстракты phaseolus vulgaris, их применение и композиции, содержащие их

Экстракты phaseolus vulgaris, их применение и композиции, содержащие их

Реферат

Сущность изобретения

Данное изобретение относится к экстрактам, полученным из семян растений рода Phaseolus, и способу их получения.

Детальнее, данное изобретение относится к экстрактам семян Phaseolus vulgaris, отличающимся содержанием ингибиторов α-амилазы и фитогемагглютининов в установленном соотношении, которые уменьшают всасывание глюкозы, получаемой из крахмала пищи, и уменьшают аппетит при повторном введении.

Уровень техники

Ингибитор α-амилазы (αАI) представляет собой гликопротеин, содержащийся в семенах фасоли обыкновенной (Phaseolus vulgaris), который подавляет ферментативную активность амилазы животного происхождения и особенно человеческой амилазы различным, видоспецифичным образом. Данный ингибитор, который был впервые выделен Marshall и Lauda в 1974 г. (J.Biol. Chem., 250(20), 8030-8037, 1975), привлек интерес, так как его действие, подавляющее активность панкреатической амилазы, может влиять на всасывание глюкозы в кишечнике (происходящее в результате ферментативного гидролиза крахмала) и быть потенциально применимо, главным образом, в пищевой промышленности. Углеводороды представляют собой важный источник калорий и способствуют синтезу жиров у людей, которые предрасположены к ожирению или диабету II типа. В природе при развитии видов доступность пищи для выживания была прерывистой, таким образом, была важнейшей способность накапливать энергию, превышающую количество, необходимое для немедленного использования. Жировые клетки, расположенные в различных частях тела, представляют собой места, где энергия накапливается, таким образом, она легкодоступна, если организм нуждается в ней. Указанная физиологическая система, управляемая эндокринной секрецией и нервной системой, дает возможность людям выживать в отсутствие пищи в течение длительных периодов. Однако в результате переедания, малоподвижного образа жизни и генетической предрасположенности, связанных с образом жизни в странах с развитой промышленностью, система неконтролируемо увеличивает отложения энергии в виде жировой ткани с неблагоприятными последствиями, такими как дефекты внешности, сопровождающиеся перегрузкой сердечно-сосудистой системы. Одну из главных проблем представляет собой ожирение, которое достигает высокого уровня в некоторых странах, таких как Соединенные Штаты Америки. Ожирение является основной причиной сердечно-сосудистых заболеваний, гипертензии и диабета. Избыточная масса, которая распространена и среди мужчин, и среди женщин, вызвана поглощением больших и больших количеств пищи и приводит к ухудшению здоровья. Так как избыточная глюкоза крови приводит к возрастанию отложения энергии, очень важно наличие веществ, которые снижают абсорбцию глюкозы.

Потребность в средствах против ожирения, распространенная в мире, привела к исследованию и изучению пищи, которая препятствует прогрессирующему накоплению массы тела.

Ингибиторы α-амилазы давно определены в различных бобовых и кукурузе, и специальные клинические испытания, проведенные в последние годы, дали неоднозначные результаты. В зависимости от способа получения, использованного для концентрирования и выделения данных ингибиторов, результаты были противоречивыми, так, многие коммерческие препараты доказано теряют эффективность in vivo. В соответствии с первыми исследованиями Layer, Carlson и Di Magno (Gastroenterology, 88(6): 1895, 1902, 1985) указанная проблема существует, очевидно, вследствие высокой степени разведения ингибитора в препаратах с высокой загрязненностью примесями; в сущности, препараты очищенного ингибитора доказанно являются активными в отношении α-амилазы при введении непосредственно в кишечник.

Частично способы, описанные в литературе для получения ингибиторов α-амилазы, предусматривают экстрагирование фосфатным буфером и перевод белков в нерастворяемую форму сульфатом аммония и не обеспечивают какую-либо избирательность. Полученные экстракты содержат высокие концентрации фитогемагглютининов и должны быть разведены для получения экстрактов с допустимым уровнем токсичности. Помимо биологического аспекта известные способы включают некоторые стадии, которые делают сложным получение продукта, так чтобы он являлся и активным и безопасным. Проблемы, которые возникают во время экстрагирования буферами различной ионной силы и рН, обусловлены высокой концентрацией белковых и полисахаридных примесей, которые делают их слишком вязкими, приводя к проблемам низкой способности к фильтрации и более длительному времени получения. Так как они представляют собой водные экстракты, высок риск микробного загрязнения белкового экстракта, которое трудно контролировать, особенно в случае высокой вязкости препаратов. Все указанные условия приводят к потере продукта и затрудняют получение конечных экстрактов с низким титром фитогемагглютининов и соответствующих многокомпонентной стандартизации. Различные способы использованы для преодоления проблемы ограничения фитогемагглютининов, включая термическую обработку, которая приводит к разрушению не только фитогемагглютининов, но и ингибиторов α-амилазы, что является причиной того, что полученный продукт почти неактивен. Действительно, имеющиеся на рынке продукты обладают очень низким содержанием αAI. Другие продукты, которые излишне высоко обогащены ингибиторами α-амилазы, вызывают неприятную проблему метеоризима при введении в больших дозах.

Описание изобретения

Продукты, соответствующие изобретению, получены экстрагированием водной или водно-этанольной средой и осаждением приемлемыми смесями этанола и воды.

Неожиданно обнаружили, что использование водно-этанольных смесей с подходящими концентрированными водными экстрактами обыкновенных бобов повышает содержание в экстрактах ингибиторов α-амилазы, обладающей активностью от 1000 до 1600 USP/мг (HPLC титр от 6 до 14% масс./масс.) и содержание фитогемагглютининов от 8000 до 30000 HAU/г, и, таким образом, может быть применено в продуктах для использования в диете при достаточно низких дозах с получением требуемого результата. В добавление к указанному главному преимуществу способ, к которому относится изобретение, вызывает значительное уменьшение количества микробов. Другое важное преимущество представляет собой возможность получения конечного продукта с повышенным содержанием (αAI) ингибитора, с определенными соотношениями фитогемагглютининов.

Способ по изобретению включает экстракцию биомассы буферами с рН в интервале от 3 до 6,5, предпочтительно рН 3,5-5,5 и еще более предпочтительно 4, при температурах от 2 до 25°С и более предпочтительно от 4 до 18°С и последующим выделением экстракта из биомассы центрифугированием.

Подходящие буферы для экстракции обычно представляют собой фосфатный, цитратный или ацетатный буферы или дикарбоновые аминокислотные буферы, предпочтительны фосфатный или цитратный буферы. Буферизированные водно-спиртовые смеси могут быть также использованы в качестве экстрагирующего растворителя.

В зависимости от использованных экстракторов и от цикла экстракции использовали от 5 до 20 объемов буфера на часть лекарственного препарата, предпочтительно 10-12,5 частей, и смесь перемешивали в течение 1-4 часов, предпочтительно 2 часа; биомасса может быть дополнительно экстрагирована более трех раз с соответствующим количеством буфера и в каком-либо случае до тех пор, пока не исчерпается содержание ингибитора α-амилазы и фитогемагглютинина.

Комбинированные экстракты очищают фильтрацией или центрифугированием и концентрируют в вакууме при температуре с 25 до 35°С, предпочтительно при 30°С, или ультрафильтрацией (с отсечкой молекул 10000 Дa) до объема, соответствующего приблизительно 10% массы экстракта после центрифугирования.

Концентрированный водный экстракт затем осаждают этанолом, добавленным до конечной концентрации от 60 до 70% объем/объем, предпочтительно 65% объем/объем, действующим при температуре от 18 до 30°С и предпочтительно от 20 до 25°С.

Полученный осадок может быть подвергнут центрифугированию и/или фильтрации, повторно растворен в дистиллированной воде и вновь осажден в 60% этаноле для уменьшения доли солей. В качестве альтернативы осадок может быть отфильтрован через мембрану с отсечкой молекул массой 10000 Дa. Отстой осадка, который составляет экстракт, соответствующий изобретению, высушивают.

Если используют указанные способы, получают экстракт со следующими свойствами:

- HPLC титр: ≥ 6% ≤14% масс./масс.;

- α-амилазу ингибирующая активность ≥ 1000 ≤ 1600 USP/мг;

- гемагглютинирующая активность ≥ 8000 ≤ 30000 HAU/г.

Эффективность экстрактов была испытана на крысах, подвергнутых воздействию доз 200 и 400 мг/кг в сутки, не ограниченных в питании специальным богатым крахмалом кормом. Во время воздействия экстрактами, соответствующими изобретению, значительно уменьшалось потребление пищи, в то время как потребление воды оставалось неизменным.

Продукт, соответствующий изобретению, прекрасно переносится и может быть введен в состав фармацевтической композиции или композиции для диеты в дозах от 50 до 1000 мг, получаемых в основные приемы пищи. Экстракт может быть введен в состав питьевых форм и т.п., принимаемых в качестве препаратов, уменьшающих аппетит.

Примеры, приведенные ниже, демонстрируют получение и преимущества изобретения.

ПРИМЕР 1: Получение экстракта обыкновенных бобов с повышенным содержанием αAI, полученного экстракцией цитратным буфером и осаждением этанолом

Суспензию 150 г измельченных обыкновенных бобов в 1,5 л лимонной кислоты 5,75 г/л перемешивали в течение 3 часов при + 4°С.

Суспензию центрифугировали и водный центрифугат концентрировали 7,5 раз (сухой остаток: 15,0% масс./масс.). Концентрат развели 95% этанолом до концентрации 65% этанола до получения осадка, который восстановили центрифугированием при +22°С. Собранное твердое вещество высушили в вакууме при температуре, не превышающей 50°С. Полученный продукт (выход продукта 2,36%) обладает ингибирующей α-амилазу активностью 1050 ед./мг, гемагглютинирующей активностью 9000 HAU/г и титром HPLC 7,3% масс./масс.

ПРИМЕР 2: Осаждение экстракта обыкновенных бобов с повышенным содержанием αAI, полученного экстракцией цитратным буфером и осаждением этанолом

Суспензию 150 г измельченных обыкновенных бобов в 1,5 л лимонной кислоты 5,75 г/л перемешивали в течение 2 часов при +22°С.

Суспензию центрифугировали и водный центрифугат концентрировали 10,5 раз (сухой остаток: 17,1% масс./масс.). Концентрат развели 95% этанолом до концентрации 65% этанола с получением осадка, который восстановили центрифугированием при +22°С. Собранное твердое вещество высушили в вакууме при температуре, не превышающей 50°С. Полученный продукт (выход продукта 3,5%) обладает ингибирующей α-амилазу активностью 1600 ед./мг, гемагглютинирующей активностью 18600 HAU/г и титром HPLC 10,0% масс./масс.

ПРИМЕР 3: Осаждение экстракта обыкновенных бобов с повышенным содержанием αAI, полученного двойной экстракцией водно-спиртовым раствором (30% этанол) лимонной кислоты и осаждением этанолом

Суспензию 100 г измельченных обыкновенных бобов в 1,0 л смеси воды и этанола в соотношении 70:30, содержащей лимонную кислоту 4,6 г/л, перемешивали в течение 2 часов при +22°С.

Суспензию центрифугировали, и чистую водную фазу отделяли, и остаток подвергали новому экстракционному циклу 750 мл воды. Жидкую фазу повторной экстракции соединили с первой и концентрировали 4,3 раза (сухой остаток: 4,78% масс./масс.). Концентрат развели 95% этанолом до концентрации 70% этанола до получения осадка, который восстановили центрифугированием при +22°С. Собранное твердое вещество высушили в вакууме при температуре, не превышающей 50°С. Полученный продукт (выход продукта 0,88%) обладает ингибирующей α-амилазу активностью 1570 ед./мг, гемагглютинирующей активностью 27000 HAU/г и титром HPLC 13,6% масс./масс.

1. Экстракт, подавляющий аппетит, полученный экстрагированием из Phaseolus vulgaris смесями этанола и воды, отличающийся содержанием ингибитора α-амилазы от 1000 до 1600 USP/мг (титр HPLC от 6 до 14% мас./мас.) и содержанием фитогемагглютининов от 8000 до 30000 HAU/г.

2. Способ получения экстракта по п.1, который предусматривает:a) экстрагирование Phaseolus vulgaris водными буферами с рН в интервале от 3 до 6,5, и последующее отделение экстракта от биомассы, которая может быть дополнительно экстрагирована буфером в случае необходимости до тех пор пока ингибиторы α-амилазы и фитогемагглютинины не будут извлечены полностью;b) фильтрацию и центрифугирование сочетанных экстрактов, и концентрированно до объема, соответствующего примерно 10% массы экстракта после центрифугирования;c) раздельное осаждение концентрированного водного экстракта разбавленным этанолом, при конечной концентрации спирта от 60 до 70% об./об.;d) отделение преципитата и повторное осаждение дистиллированной водой с 60% этанолом, или фильтрацию через мембрану с отсечкой молекул массой 10000 Да и высушивание остатка преципитата.

3. Способ по п.2 в котором используют фосфатный, цитратный или ацетатный буферы, дикарбоновые аминокислотные буферы или буферированные водно-спиртовые растворы.

4. Применение экстрактов по п.1 для получения композиции, полезной в качестве средства, подавляющего аппетит.

5. Фармацевтическая или диетическая композиция, подавляющая аппетит, содержащая в качестве активного ингредиента экстракт по п.1.