Инсулинотропный комплекс, в котором использован фрагмент иммуноглобулина

Инсулинотропный комплекс, в котором использован фрагмент иммуноглобулина

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к конъюгату инсулинотропного пептида, предназначенному для использования в композициях инсулинотропных пептидов длительного действия. Конкретно настоящее изобретение относится к модифицированному конъюгату инсулинотропного пептида, имеющему значительно увеличенную продолжительность действия за счет ковалентного связывания инсулинотропного пептида с непептидным полимером и Fc-фрагментом иммуноглобулина, а также к способу получения этого конъюгата.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Пептиды имеют тенденцию к легкому денатурированию из-за своей низкой стабильности, разрушению in vivo под действием протеолитических ферментов, что приводит к потере активности, и, кроме того, имеют относительно небольшой размер, что позволяет им легко проходить через почки. Соответственно, для поддержания уровня в крови и титров лекарственных средств, содержащих пептид в качестве фармацевтически эффективного компонента, пептидные лекарственные средства необходимо часто вводить пациенту. Однако лекарственные средства на основе пептидов, как правило, вводят в форме препаратов для инъекций, и такое частое введение вызывает сильные болевые ощущения у пациентов. Для решения этой проблемы предпринимались значительные усилия. Одной из попыток было введение пептидного лекарственного средства путем ротоглоточной или носоглоточной ингаляции, повышая перенос пептидного лекарственного средства через биологические мембраны. Однако с помощью этого подхода по-прежнему трудно поддерживать активность пептидного лекарственного средства in vivo из-за невысокой эффективности переноса in vivo по сравнению с инъекцией.

С другой стороны, предпринимались значительные усилия для улучшения стабильности пептидных лекарственных средств в крови и для поддержания высоких уровней лекарственных средств в крови в течение продолжительного периода времени для максимального увеличения фармацевтической эффективности препаратов. Следовательно, для получения пептидных лекарственных средств длительного действия необходимо повысить стабильность пептидных лекарственных средств и поддерживать их титры на достаточно высоком уровне, не вызывая иммунный ответ у пациентов.

Что касается способа стабилизации пептидов и ингибирования их деградации под действием протеолитических ферментов, был проведен ряд экспериментов с целью модифицировать специфическую аминокислотную последовательность, чувствительную к действию протеолитического фермента. Например, пептид GLP-1 (амид 7-37 или 7-36), функция которого связана с уменьшением концентрации глюкозы в крови при лечении диабета 2 типа, обладает коротким полупериодом физиологической активности, составляющим примерно 4 минуты или менее (Kreymann et al., 1987), из-за снижения титров GLP-1 вследствие расщепления между 8-м (Ala) и 9-м (Asp) аминокислотными остатками под действием дипептидилпептидазы IV (DPP IV). В результате были проведены различные исследования аналогов GLP-1, обладающих устойчивостью к DPP-IV, и были выполнены эксперименты по замене Ala⁸ на Gly (Deacon et al., 1998; Brucelin et al., 1999), или на Leu, или D-Ala (Xiao et al., 2001), что позволяло повысить устойчивость к DPP IV при сохранении активности. N-концевая аминокислота GLP-1, а именно His⁷, является решающей в отношении активности GLP-1 и служит мишенью DPP IV. Соответственно в патенте США № 5545618 описана модификация N-конца с использованием алкильной или ацильной группы, и в документе Gallwitz et al. описано, что His в 7-м положении может быть N-метилирован или альфа-метилирован или же His может быть целиком заменен на имидазол с увеличением устойчивости к действию DPP IV и поддержанием физиологической активности.

Кроме описанных модификаций, эксендин-4, который является аналогом GLP-1, выделенным из слюнных желез гигантской ящерицы ядозуба (патент США № 5424686), обладает устойчивостью к действию DPP IV и более высокой физиологической активностью, чем GLP-1. В результате время его полужизни in vivo составляет от 2 до 4 часов, что превышает аналогичное время для GLP-1. Однако в случае повышения устойчивости только к действию DPP IV физиологическая активность не поддерживается на достаточном уровне, и, например, коммерчески доступный эксендин-4 (эксенатид) необходимо вводить в виде инъекции пациенту два раза в день, что опять создает неудобства для пациента.

Проблема, связанная с указанными инсулинотропными пептидами, в основном связана с тем, что они обладают незначительным размером. Так, например, они не могут возвращаться в циркуляцию из почек и в результате выводятся из организма. Соответственно, использовали способ химического присоединения к молекуле пептида полимерного вещества, имеющего высокую растворимость, например полиэтиленгликоля (ПЭГ), для ингибирования его выведения через почки.

ПЭГ неспецифически связывается с определенным сайтом или различными сайтами мишеневого пептида, обеспечивая эффект увеличения молекулярной массы пептида, и, таким образом, ингибирует выведение пептида почками и предотвращает гидролиз, не вызывая каких-либо побочных эффектов. Например, в международной патентной публикации WO 2006/076471 указано, что ПЭГ связывается с натрийуретическим пептидом B-типа или BNP, который связывается с NPR-A, активируя выработку цГМФ, что приводит к снижению артериального давления, и в результате конъюгат используют в качестве терапевтического средства при застойной сердечной недостаточности, тем самым поддерживая физиологическую активность. В патенте США № 6924264 описано, что ПЭГ связывается с лизином эксендина-4, повышая время его присутствия in vivo. Однако при этом способе повышается молекулярная масса ПЭГ, за счет чего возрастает время пребывания пептидного лекарственного средства in vivo, одновременно с повышением молекулярного веса значительно снижается титр пептидного лекарственного средства и его реакционная способность также падает. Соответственно, имеет место нежелательное снижение эффективности.

В международной патентной публикации WO 02/46227 описан слитый белок, полученный путем объединения GLP-1, эксендина-4 или их аналогов с сывороточным альбумином человека или фрагментом иммуноглобулина (Fc) с использованием генетических методик рекомбинантных ДНК. В патенте США 6756480 описан слитый Fc-белок, полученный путем объединения паратиреоидного гормона (PTH) и его аналога с Fc-фрагментом. Эти способы позволяют решить такие трудности, как низкий выход и отсутствие специфичности при ПЭГилировании, но они по-прежнему не могут решить проблему, связанную с тем, что эффект увеличения времени полужизни в крови не столь значим, как ожидалось, и в некоторых случаях титры также низкие. Для получения максимального эффекта увеличения времени полужизни в крови используются разные пептидные линкеры, но они могут вызывать иммунный ответ. Кроме того, если используется пептид, содержащий дисульфидные связи, например BNP, то существует высокая вероятность неправильной укладки цепи. В результате такие пептиды вряд ли могут найти применение.

Кроме того, производное GLP-1, а именно NN2211, получают замещением аминокислотного остатка GLP-1 и связывают с ацильной боковой цепью с образованием нековалентной связи с альбумином, что ведет к увеличению времени пребывания in vivo. Однако время полужизни этого производного составляет от 11 до 15 часов, что не является значительным приростом по сравнению с эксендином-4. Таким образом, производные GLP-1 до сих пор необходимо вводить путем инъекции один раз в день (Nauck et al., 2004). Кроме того, CJC-1131 представляет собой производное GLP-1, содержащее малеимидную функциональную группу для ковалентного связывания GLP-1 с альбумином крови, и предпринимались усилия, направленные на использование CJC-1131 с целью увеличения времени полужизни in vivo, однако сейчас эти попытки прекращены. Предложенное впоследствии соединение, а именно CJC-1134, представляет собой эксендин-4, который ковалентно связан с рекомбинантным альбумином, и этот продукт не демонстрирует значительного эффекта повышения стабильности в крови, причем время его полужизни в крови составляет примерно 17 часов (у крыс) (Thibauoleau et al., 2006).

РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Техническая проблема

Таким образом, авторы настоящего изобретения осуществили сайт-специфичное связывание Fc-фрагмента иммуноглобулина и непептидного полимера с инсулинотропным пептидом по аминокислотному остатку, отличному от N-концевого, с помощью ковалентной связи и обнаружили, что конъюгат по настоящему изобретению проявляет значительно увеличенную эффективность in vivo и обладает увеличенным временем полужизни. В частности, авторы изобретения установили, что среди прочих конъюгатов инсулинотропных пептидов конъюгаты таких пептидов, как эксендин-4, дезаминогистидилэксендин-4, в котором удалена N-концевая аминогруппа эксендина-4, бета-гидроксиимидазопропионилэксендин-4, в котором N-концевая аминогруппа эксендина-4 замещена гидроксильной группой, диметилгистидилэксендин-4, в котором N-концевая аминогруппа эксендина-4 модифицирована введением двух метильных групп, и имидазоацетилэксендин-4, в котором удалены альфа-атом углерода первого остатка гистидина и связанная с ним N-концевая аминогруппа, демонстрируют значительное увеличение эффективности in vivo и времени полужизни.

Техническое решение

Целью настоящего изобретения являлось создание лекарственного средства инсулинотропного пептида длительного действия, обладающего способностью сохранять активность инсулинотропного пептида in vivo с повышенным временем полужизни в крови.

Краткое описание чертежей

На фиг.1 показаны результаты ВЭЖХ на обращенной фазе, предназначенной для определения чистоты конъюгата нативный эксендин-4(N)-ПЭГ-Fc-фрагмент иммуноглобулина.

На фиг.2 показаны результаты ВЭЖХ на обращенной фазе, предназначенной для определения чистоты конъюгата нативный эксендин-4(Lys)-ПЭГ-Fc-фрагмент иммуноглобулина.

На фиг.3 показаны результаты ВЭЖХ на обращенной фазе, предназначенной для определения чистоты конъюгата дезаминогистидилэксендин-4(Lys)-ПЭГ-Fc-фрагмент иммуноглобулина.

На фиг.4 показаны результаты ВЭЖХ на обращенной фазе, предназначенной для определения чистоты конъюгата (2-гидрокси-3-(1H-имидазол-4-ил)пропионил)эксендин-4(Lys)-ПЭГ-Fc-фрагмент иммуноглобулина.

На фиг.5 показаны результаты ВЭЖХ на обращенной фазе, предназначенной для определения чистоты конъюгата (2-(1H-имидазол-4-ил)ацетил)эксендин-4(Lys)-ПЭГ-Fc-фрагмент иммуноглобулина.

На фиг.6 показаны результаты ВЭЖХ на обращенной фазе, предназначенной для определения чистоты конъюгата Ser12 мутированного дезаминогистидилэксендина-4(Lys)-ПЭГ-Fc-фрагмент иммуноглобулина.

На фиг.7 показаны результаты ВЭЖХ на обращенной фазе, предназначенной для определения чистоты конъюгата Arg12 мутированного дезаминогистидилэксендина-4(Lys)-ПЭГ-Fc-фрагмент иммуноглобулина.

На фиг.8 показаны результаты ВЭЖХ на обращенной фазе, предназначенной для определения чистоты конъюгата дезаминогистидилэксендин-4(Lys)-ПЭГ-альбумин сыворотки человека (HSA).

На фиг.9 показаны результаты ВЭЖХ на обращенной фазе, предназначенной для определения чистоты конъюгата диметилгистидилэксендин-4(Lys)-ПЭГ-Fc-фрагмент иммуноглобулина.

На фиг.10 показаны результаты ВЭЖХ на обращенной фазе, предназначенной для определения чистоты конъюгата GLP-1(N)-ПЭГ-Fc-фрагмент иммуноглобулина.

На фиг.11 показаны результаты ВЭЖХ на обращенной фазе, предназначенной для определения чистоты конъюгата дезаминогистидил GLP-1(Lys)-ПЭГ-Fc-фрагмент иммуноглобулина.

На фиг.12 показаны результаты ВЭЖХ на обращенной фазе, предназначенной для определения чистоты конъюгата нативный эксендин-4(Lys)-ПЭГ-Fc-фрагмент иммуноглобулина.

На фиг.13 показаны результаты определения чистоты конъюгата (2-(1H-имидазол-4-ил)ацетил)эксендин-4(Lys)-ПЭГ-Fc-фрагмент иммуноглобулина с помощью 12% SDS-PAGE.

На фиг.14 показаны результаты измерения эффекта уменьшения концентрации глюкозы в крови, вызванного конъюгатом дезаминогистидилэксендин-4(Lys)-ПЭГ-Fc-фрагмент иммуноглобулина.

Наилучший способ осуществления изобретения

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения разработан конъюгат инсулинотропного пептида длительного действия, в котором инсулинотропный пептид и непептидный полимер, содержащий реакционноспособные группы на обоих концах молекулы, ковалентно связаны друг с другом.

Инсулинотропный пептид по настоящему изобретению представляет собой пептид, обладающий инсулинотропным действием, т.е. способствующий синтезу и экспрессии инсулина в бета-клетках поджелудочной железы. К этим пептидам относятся предшественники, агонисты, производные, фрагменты и варианты, и предпочтительно GLP (глюкагоноподобный пептид)-1, эксендин 3 и эксендин 4.

GLP-1 представляет собой гормон, который секретируется в тонком кишечнике и в целом содействует биосинтезу и секреции инсулина, ингибирует секрецию глюкагона и стимулирует поглощение глюкозы в клетках. В тонком кишечнике предшественник глюкагона распадается на три пептида, а именно глюкагон, GLP-1 и GLP-2. В данном случае под GLP-1 понимают GLP-1(1-37), который первоначально находится в форме, не обладающей инсулинотропным действием. Но впоследствии эта форма перерабатывается и превращается в активированную форму GLP-1 (7-37). GLP-1 (7-37) имеет следующую аминокислотную последовательность:

GLP-1 (7-37)

HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK EPIAW LVKGR G

Термин «производное GLP-1» означает пептид, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере на 80% гомологична аминокислотной последовательности GLP-1, возможно, в химически модифицированной форме, и который проявляет инсулинотропное действие, по меньшей мере эквивалентное или превосходящее инсулинотропное действие GLP-1.

Термин «фрагмент GLP-1» означает фрагмент в форме, в которой один или несколько аминокислотных остатков присоединены или удалены с N-конца или C-конца нативного GLP-1, где присоединенные аминокислотные остатки, возможно, являются аминокислотами неприродного происхождения (например, D-аминокислотами).

Термин «вариант GLP-1» означает пептид, обладающий инсулинотропным действием, который содержит одну или несколько аминокислотных последовательностей, отличающихся от последовательностей нативного GLP-1.

Эксендин 3 и эксендин 4 представляют собой инсулинотропные пептиды, состоящие из 39 аминокислот, которые на 53% гомологичны аминокислотной последовательности GLP-1. Эксендин-3 и эксендин-4 имеют следующие аминокислотные последовательности:

эксендин-3

HSDGT FTSDL SKQME EEAVR LFIEW LKNGG PSSGA PPPS

эксендин-4

HGEGT FTSDL SKQME EEAVR LFIEW LKNGG PSSGA PPPS

Термин «агонист эксендина» означает соединение, которое взаимодействует с рецепторами in vivo и обладает такой же биологической активностью, как и эксендин, причем его структура не является родственной структуре эксендина. Термин «производное эксендина» означает пептид, который по меньшей мере на 80% гомологичен аминокислотным последовательностям нативного эксендина, в котором некоторые группы аминокислотных остатков могут быть химически замещены (например, альфа-метилирование, альфа-гидроксилирование), удалены (например, деаминирование) или модифицированы (например, N-метилирование) и который обладает инсулинотропным действием.

Термин «фрагмент эксендина» означает фрагмент, в котором на N-конце или C-конце молекулы нативного эксендина присоединены или удалены один или несколько аминокислотных остатков, в который могут входить неприродные аминокислоты (например, D-аминокислоты) и который обладает инсулинотропным действием.

Термин «вариант эксендина» означает пептид, который отличается от нативного эксендина по меньшей мере одной аминокислотной последовательностью и при этом обладает инсулинотропным действием.

Каждый из способов получения агонистов, производных, фрагментов и вариантов эксендина может использоваться самостоятельно или в комбинациях. Например, настоящее изобретение относится к инсулинотропному пептиду с аминокислотной последовательностью, в которой существует отличие по меньшей мере на один аминокислотный остаток от последовательности нативного инсулинотропного пептида и имеющий дезаминированный остаток на N-конце.

В конкретном варианте осуществления нативный инсулинотропный пептид, используемый в настоящем изобретении, и модифицированный инсулинотропный пептид могут быть синтезированы с использованием твердофазного способа синтеза и большинство нативных пептидов, включая нативные инсулинотропные пептиды, могут быть получены с помощью рекомбинантных методик.

Кроме того, инсулинотропный пептид, используемый в настоящем изобретении, может связываться с непептидным полимером на различных сайтах.

Конъюгат пептида, полученный по настоящему изобретению, может обладать активностью, которая изменяется в зависимости от сайта присоединения инсулинотропного пептида.

Например, конъюгат может быть связан на N-конце и на другом концевом участке, отличном от N-конца, например на C-конце соответственно, что указывает на различные активности in vitro. Реакционноспособная альдегидная группа селективно присоединяется к N-концу при низких значениях pH и может связываться с остатком лизина с образованием ковалентной связи при высоких значениях pH, например, pH 9,0. Реакция ПЭГилирования может проходить при различных значениях pH, после чего изомеры положения могут быть выделены из реакционной смеси с использованием ионообменной колонки.

Если инсулинотропный пептид необходимо присоединить на сайте, отличном от N-конца, который является важным сайтом, определяющим активность in vivo, то с помощью малеимидного линкера в молекуле непептидного полимера в аминокислотный остаток на соответствующем сайте может быть введена реакционноспособная тиольная группа, модифицирующая нативную аминокислотную последовательность образованием ковалентной связи.

Если инсулинотропный пептид необходимо присоединить на сайте, отличном от N-конца, который является важным фрагментом, определяющим активность in vivo, то с помощью альдегидного линкера в молекуле непептидного полимера в аминокислотный остаток на соответствующем сайте может быть введена реакционноспособная аминогруппа, модифицирующая нативную аминокислотную последовательность с образованием ковалентной связи.

Если используется альдегидный линкер в молекуле непетидного полимера, то он взаимодействует с аминогруппой, находящейся на N-конце, и остатками лизина, и модифицированная форма инсулинотропного пептида может использоваться для селективного увеличения выхода реакции. Например, на желаемом сайте может быть сохранена только одна аминогруппа, которую необходимо ввести в реакцию, способами блокирования N-конца, методикой замещения остатка лизина, способом введения аминогруппы по карбокси-концу и тому подобным, что позволяет повысить выход реакций ПЭГилирования и сочетания. Способы защиты N-концевой аминогруппы включают, но ими не ограничиваются, диметилирование, а также метилирование, деаминирование, ацетилирование и тому подобное.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления конъюгат инсулинотропного пептида по настоящему изобретению представляет собой конъюгат инсулинотропного пептида, в котором Fc-фрагмент иммуноглобулина специфично связан с аминогруппой, отличной от аминогруппы, расположенной на N-конце инсулинотропного пептида. В одном из конкретных вариантов осуществления авторы настоящего изобретения осуществили ПЭГилирование нативного эксендина-4 при pH 9,0, селективно присоединив ПЭГ к остатку лизина инсулинотропного пептида. В качестве альтернативы для ПЭГилирования остатка Lys, осуществляли ПЭГилирование производных эксендина-4, в которых N-конец удален или защищен, при pH 7,5. ПЭГилирование N-конца блокировали либо удалением альфа-аминогруппы N-концевого гистидина, либо замещением N-концевой аминогруппы гидроксильной группой, либо модификацией альфа-аминогруппы N-концевого гистидина введением двух метильных групп, либо удалением альфа-углерода первой аминокислоты (гистидина) и связанной с ним N-концевой аминогруппы с сохранением имидазоацетильной группы и т.д. Эти производные представлены следующими химическими формулами:

<Химическая формула 1>

(а)		(b)
Дезаминогистидил (DA)-эксендин-4	Бета-гидроксиимидазопропил (HY)-эксендин-4
(c)		(d)
Имидазоацетил (CA)-эксендин-4	Диметилгистидил (DM)-эксендин-4

В отличие от связывания к N-концу, при присоединении ПЭГ к остатку лизина, а не к N-концу сохраняется уровень активности in vitro, равный примерно 8,5% (см. таблицу). Кроме того, даже если конъюгаты Fc и дезаминогистидилэксендина-4 (в описании обозначен как DA-эксендин-4), полученного удалением N-концевой аминогруппы эксендина-4, бета-гидроксиимидазопропилэксендина-4 (в описании обозначен как HY-эксендин-4), полученного замещением N-концевой аминогруппы эксендина-4 гидроксильной группой, диметилгистидилэксендина-4 (в описании обозначен как DM-эксендин-4), полученного модификацией N-концевой аминогруппы эксендина-4 введением двух метильных групп, и имидазоацетилэксендина-4 (в описании обозначен как CA-эксендин-4), полученного удалением α-углерода первого остатка гистидина в молекуле эксендина-4 и связанной с ним N-концевой аминогруппы, показывали сопоставимую активность in vitro и время полужизни в крови по сравнению с конъюгатом нативного эксендина-4 (см. таблицу), то указанные конъюгаты демонстрировали неожиданно высокую продолжительность эффективного действия in vivo (фиг. 14). Конъюгат DM-эксендин-4 и Fc-фрагмент иммуноглобулина, конъюгат DA-эксендин-4 и Fc-фрагмент иммуноглобулина, конъюгат CA-эксендин-4 и Fc-фрагмент иммуноглобулина и конъюгат HY-эксендин-4 и Fc-фрагмент иммуноглобулина, полученные по настоящему изобретению, продемонстрировали увеличение времени полужизни в крови до 50 часов или более. Уменьшение титра также было максимально уменьшено связыванием с остатком Lys, который не влияет на активность пептида. Кроме того, наблюдалась неожиданно высокая активность снижения высоких уровней глюкозы при удалении аминогруппы или альфа-углерода на N-конце пептида.

Fc-фрагмент иммуноглобулина безопасен для использования в качестве носителя действующего пептида, поскольку является биоразрушаемым полипептидом, который подвергается метаболизму in vivo. Кроме того, Fc-фрагмент иммуноглобулина обладает относительно низкой молекулярной массой по сравнению с полноразмерной молекулой иммуноглобулина и, таким образом, является предпочтительным с точки зрения получения, очистки и эффективности конъюгата. Поскольку Fc-фрагмент иммуноглобулина не содержит Fab-фрагмента, аминокислотная последовательность которого различается в зависимости от подклассов антитела и который, таким образом, в значительной степени неоднороден, можно ожидать, что Fc-фрагмент иммуноглобулина может в значительной степени увеличить однородность препарата и являться менее антигенным.

Инсулинотропный пептид, используемый в настоящем изобретении, связывают с носителем и непептидным полимером.

Носитель, который может использоваться в настоящем изобретении, может быть выбран из группы, состоящей из Fc-фрагмента иммуноглобулина, альбумина, трансферрина и ПЭГ, и предпочтительно представляет собой Fc-фрагмент иммуноглобулина.

Термин «Fc-фрагмент иммуноглобулина» в настоящей заявке относится к константной области 2 тяжелой цепи (C_H2) и константной области 3 тяжелой цепи (C_H3) иммуноглобулина, а не к вариабельным областям тяжелой и легкой цепей, константной области 1 тяжелой цепи (C_H1) и константной области 1 легкой цепи (C_L1) иммуноглобулина. Fc-фрагмент может дополнительно содержать шарнирную область константной области тяжелой цепи. Кроме того, Fc-фрагмент иммуноглобулина по настоящему изобретению может включать часть или весь Fc-фрагмент, в том числе константную область 1 тяжелой цепи (C_H1) и/или константную область 1 легкой цепи (C_L1), за исключением вариабельных областей тяжелой и легкой цепей, если обладает физиологическим действием, в основном сходным с нативным белком или превосходящим его. Кроме того, Fc-фрагмент Ig может быть фрагментом, в котором имеется делеция относительно протяженной части аминокислотной последовательности в областях C_H2 и/или C_H3. То есть Fc-фрагмент иммуноглобулина по настоящему изобретению может включать 1) домен C_H1, домен C_H2, домен C_H3 и домен C_H4, 2) домен C_H1 и домен C_H2, 3) домен C_H1 и домен C_H3, 4) домен C_H2 и домен C_H3, 5) комбинацию одного или нескольких доменов и шарнирной области иммуноглобулина (или части шарнирной области) и 6) димер каждого из доменов константных областей тяжелой цепи и константной области легкой цепи.

Fc-фрагмент иммуноглобулина по настоящему изобретению включает нативную аминокислотную последовательность и ее производные (продукты мутаций). Производное аминокислотной последовательности представляет собой последовательность, которая отличается от нативной аминокислотной последовательности за счет делеций, вставок, неконсервативных или консервативных замещений или комбинаций перечисленного, относящихся к одному или нескольким аминокислотным остаткам. Например, в Fc IgG, аминокислотные остатки, которые, как известно, играют важную роль в связывании в положениях 214-238, 297-299, 318-322 или 327-331, могут использоваться как подходящие мишени для модификации. Кроме того, возможны другие разнообразные производные, включая производные, в которых удалена область, способная к образованию дисульфидных связей, или удалены некоторые остатки на N-конце нативной формы Fc или к последовательности добавлен метиониновый остаток. Кроме того, для ликвидации эффекторных функций может осуществляться делеция на комплемент-связывающем сайте, например C1q-связывающем сайте и сайте ADCC (антитело-зависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности). Методики получения таких производных последовательностей Fc-фрагмента иммуноглобулина раскрыты в международных патентных публикациях WO 97/34631 и WO 96/32478.

Из уровня техники известны аминокислотные замены в белках и пептидах, которые в целом не изменяют активность молекул (H.Neurath, R.L. Hill, The proteins, Academic Press, New York, 1979). Наиболее часто встречающимися заменами являются Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu и Asp/Gly в обоих направлениях.

Если это желательно, Fc-фрагмент может быть модифицирован путем фосфорилирования, сульфатирования, акрилирования, гликозилирования, метилирования, фарнезилирования, ацетилирования, амидирования и тому подобного.

Указанные выше производные Fc-фрагмента представляют собой производные, которые имеют биологическую активность, идентичную фрагменту Fc по настоящему изобретению, или лучшую структурную устойчивость, например, по отношению к действию тепла, pH или тому подобное.

Помимо этого, эти Fc-фрагменты могут быть получены из нативных форм, выделенных из организмов людей, а также других животных, включая коров, коз, свиней, мышей, кроликов, хомяков, крыс и морских свинок, или же они могут быть рекомбинантными продуктами или их производными, полученными из трансформированных животных клеток или микроорганизмов. Для целей настоящего изобретения они могут быть получены из нативного иммуноглобулина, путем выделения целых молекул иммуноглобулина из организма человека или животных и обработки их протеолитическими ферментами. Папаин расщепляет нативный иммуноглобулин на Fab- и Fc-фрагменты, и обработка пепсином приводит к получению pF'c- и F(ab)₂-фрагментов. Эти фрагменты можно подвергнуть, например, эксклюзионной хроматографии для выделения Fc или pF'c.

Предпочтительно Fc-фрагмент человека представляет собой Fc-фрагмент рекомбинантного иммуноглобулина, который получают из микроорганизмов.

Кроме того, Fc-фрагмент иммуноглобулина по настоящему изобретению может представлять собой форму, включающую нативные цепи сахаров, увеличенные по сравнению с нативной формой цепи сахаров или уменьшенные по сравнению с нативной формой цепи сахаров, или же они могут представлять собой дегликозилированную форму. Увеличение, уменьшение или удаление цепей сахаров Fc-фрагмента иммуноглобулина может быть достигнуто обычными способами, известными в данной области, например химическими способами, способами с использованием ферментов и способами генной инженерии с использованием микроорганизмов. Удаление цепей сахаров из Fc-фрагмента ведет к резкому повышению сродства связывания с фрагментом C1q первого компонента комплемента C1 и уменьшению или потере антитело-зависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности или комплемент-зависимой цитотоксичности, в результате чего не происходит инициирование ненужных иммунных ответов in vivo. С этой точки зрения Fc-фрагмент иммуноглобулина в дегликозилированной или агликозилированной форме может оказаться более подходящим для целей настоящего изобретения в качестве носителя лекарственного компонента.

В настоящей заявке термин «дегликозилирование» относится к ферментному удалению фрагментов сахаров из Fc-фрагмента, а термин «агликозилирование» означает, что Fc-фрагмент получен в форме, не содержащей фрагментов гликозидов с помощью прокариот, предпочтительно E.coli.

С другой стороны, Fc-фрагмент иммуноглобулина может быть получен из организмов людей или животных, включая коров, коз, свиней, мышей, кроликов, хомяков, крыс и морских свинок, и предпочтительно людей. Помимо этого, Fc-фрагмент иммуноглобулина может быть Fc-фрагментом, который получен из IgG, IgA, IgD, IgE и IgM или который получен из их комбинаций или гибридов. Предпочтительно фрагмент получают из IgG или IgM, которые относятся к числу наиболее часто встречающихся белков человеческой крови, и наиболее предпочтительно из IgG, который, как известно, увеличивает время полужизни лиганд-связывающих белков.

С другой стороны, термин «комбинация» в настоящей заявке означает, что полипептиды, образующие фрагменты одной цепи Fc-фрагмента иммуноглобулина одного происхождения, связывают с полипептидной цепью другого происхождения с получением димера или мультимера. Т.е. димер или мультимер может быть сформирован из двух или нескольких фрагментов, выбранных из группы, состоящей из фрагментов IgG Fc, IgA Fc, IgM Fc, IgD Fc и IgE Fc.

Термин «гибрид» в настоящей заявке означает, что в единой цепи Fc-фрагмента иммуноглобулина присутствуют последовательности, образующие два или несколько Fc-фрагментов иммуноглобулина различного происхождения. В настоящем изобретении возможны различные типы гибридов. Т.е. доменные гибриды могут состоять из одного-четырех доменов, выбранных из группы, состоящей из доменов C_H1, C_H2, C_H3 и C_H4 IgG Fc, IgM Fc, IgA Fc, IgE Fc и IgD Fc, а также могут включать шарнирную область.

С другой стороны, IgG подразделяются на подклассы IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, и настоящее изобретение включает их комбинации и гибриды. Предпочтительными являются подклассы IgG2 и IgG4, и наиболее предпочтительным является Fc-фрагмент IgG4, который реже имеет эффекторные функции, например CDC (комплемент-зависимую цитотоксичность).

Т.е. в качестве носителя действующего пептида по настоящему изобретению наиболее предпочтительным Fc-фрагментом иммуноглобулина является негликозилированный Fc-фрагмент, являющийся производным IgG4. Fc-фрагмент, выделенный из иммуноглобулина человеческого происхождения, является более предпочтительным, чем Fc-фрагмент иммуноглобулина нечеловеческого происхождения, который может действовать как антиген в организме человека и вызывать нежелательные иммунные ответы, например вызывать выработку нового антитела против этого антигена.

Термин «непептидный полимер» в настоящем описании относится к биосовместимому полимеру, включающему два или более повторяющихся звена, связанных друг с другом любой ковалентной связью за исключением пептидной связи.

Непептидный полимер, который может использоваться в настоящем изобретении, может быть выбран из группы, состоящей из полиэтиленгликоля, полипропиленгликоля, сополимеров этиленгликоля и пропиленгликоля, полиоксиэтилированных полиолов, поливинилового спирта, полисахаридов, декстрана, поливинилэтилового эфира, биоразрушаемых полимеров, таких как PLA (полимолочная кислота) и PLGA (полимолочная-гликолевая кислота), липидных полимеров, хитинов, гиалуроновой кислоты и их комбинаций, и предпочтительно представляет собой полиэтиленгликоль. Кроме того, в объем настоящего изобретения включены их производные, которые хорошо известны в технике и легко могут быть получены специалистом в данной области.

Недостатком пептидного линкера, который используется в слитых белках, полученных стандартным способом слияния в рамке считывания, является тем, что он легко расщепляется in vivo под действием протеолитических ферментов, и в силу этого не удается получить ожидаемого значительного эффекта увеличения времени полужизни действующего пептида в крови при применении носителя. Однако в настоящем изобретении для сохранения времени полужизни пептида в крови примерно на уровне этого времени для носителя может быть применен полимер, обладающий устойчивостью к протеолитическим ферментам. Следовательно, любой непептидный полимер, который может использоваться в настоящем изобретении, может применяться без каких-либо ограничений, если он является полимером, имеющим упомянутые выше свойства, а именно является полимером, устойчивым к действию протеолитических ферментов in vivo. Непептидный полимер предпочтительно имеет молекулярную массу в диапазоне от 1 до 100 КДа, и более предпочтительно от 1 до 20 КДа. Кроме того, непептидный полимер по настоящему изобретению, связанный с Fc-фрагментом иммуноглобулина, может являться одним полимером или представлять собой комбинацию полимеров различных типов.

Непептидный полимер, используемый в настоящем изобретении, включает реакционноспособную группу, способную связываться с Fc-фрагментом иммуноглобулина и пептидным действующим средством.

Непептидный полимер содержит реакционноспособные группы на обоих концах молекулы, которые предпочтительно выбраны из альдегидной группы, остатка пропионового альдегида, остатка бутиральдегида, малеимидной группы и производных сукцинимида. Производные сукцинимида могут представлять собой сукцинимидилпропионат, гидроксисукцинимидил, сукцинимидилкарбоксиметил или сукцинимидилкарбонат. В частности, если непептидный полимер содержит альдегидные группы на обоих концах молекулы, он способен связываться по обоим концам с физиологически активным полипептидом и иммуноглобулином с минимальными побочными взаимодействиями. Конечный продукт, получаемый восстановительным алкилированием альдегидной связи, значительно более стабилен, чем продукт, содержащий амидные связи. Альдегидная функциональная группа селективно связывается с N-концом при низких значениях pH и может связываться с остатком лизина с образованием ковалентной связи при высоких значениях pH, например pH 9,0.

Реакционноспособные группы на обоих концах молекулы непептидного полимера могут быть одинаковыми или различными. Например, непептидный полимер на одном из концов молекулы может содержать малеимидную группу и на другом конце молекулы альдегидную группу, остаток пропионового альдегида или остаток бутиральдегида. Если в качестве непептидного полимера применяется полиэтиленгликоль, содержащий гидроксигруппы на обоих концах молекулы, эти гидроксигруппы могут быть активированы путем превращения в различные реакционноспособные группы с помощью известных химических реакций, или же для получения конъюгата инсулинотропного пептида по настоящему изобретению можно применять коммерчески доступные полиэтиленгликоли, содержащие модифицированные реакционноспособные группы.

Конъюгат инсулинотропного пептида по настоящему изобретению сохраняет обычную активность инсулинотропного пептид