Набор штаммов бактерий вида francisella tularensis для получения комплекта контрольных днк препаратов, комплект днк препаратов для генно-диагностических исследований

Набор штаммов бактерий вида francisella tularensis для получения комплекта контрольных днк препаратов, комплект днк препаратов для генно-диагностических исследований

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано в диагностике возбудителя особо опасных инфекций, а именно определения вида и подвида возбудителя туляремии, а также при конструировании генно-диагностических препаратов.

Известно, что возбудитель туляремии относится к подклассу протобактерий, семейству Francisellaceae, роду Francisella и представлен видами Francisella tularensis, Francisella novicida, Francisella philomiragia. Внутри вида Francisella tularensis выделяют три подвида: tularensis, holarctica, mediasiatica (1). Патогенность туляремийного микроба зависит от его подвида. Наибольшей вирулентностью для человека обладает подвид tularensis (тип А). Подвиды holarctica (тип В) и mediasiatica характеризуются меньшей вирулентностью для человека. Различия в патогенности являются одним из признаков дифференциации подвидов туляремийного микроба. Выявление возбудителя туляремии в биологическом материале и пробах из объектов окружающей среды проводят согласно МУ 3.1.2007-05 (2).

При массовом исследовании применяют серологические, иммунологические методы, например, реакция нейтрализации антител (РНАт) с туляремийным антигенным эритроцитарным диагностикумом, иммуноферментный анализ (ИФА), чувствительность которых составляет 10⁴-10⁵ м.к. в 1 мл или 5 нг/антигена мл. Продолжительность исследования составляет до 4-5 часов. Иммунофлуоресцентный метод (РИФ) при такой же чувствительности позволяет выявлять возбудителя в течение 1 ч. Однако определить подвид возбудителя этими методами невозможно. Бактериологические методы для исследования материала из объектов окружающей среды не используют, так как посевы загрязнены посторонней микрофлорой. Самый эффективный способ обнаружения туляремийного микроба - биологическая проба. Белые мыши, зараженные материалом, содержащим возбудителя туляремии, погибают на 3-4, 7-9 сутки в зависимости от вирулентности микроба. На современном уровне проведения диагностического исследования применяют ПЦР - анализ (полимеразная цепная реакция) для индикации и ускоренной диагностики, который по чувствительности и скорости получения результата превышает все описанные выше методы. Однако идентификация возбудителя туляремии с учетом подвидовой дифференциации не проводится, ввиду отсутствия диагностических препаратов. Тем не менее, широкое перемещение из различных стран ближнего и дальнего зарубежья грузов, транспорта, лиц с ручным багажом, занимающихся коммерческой деятельностью, может явиться источником появления на территории РФ возбудителя туляремии любого подвида. В этом случае своевременная и точная диагностика возбудителя туляремии будет способствовать быстрому решению эпидемиологических вопросов.

При изучении различных свойств возбудителя туляремии исследователи используют для сравнения штаммы возбудителя туляремии, доступные для данного региона.

Известен штамм бактерий Francisella tularensis B399 A-CoLe Strr 2500/K неарктического подвида, аттенуированный для приготовления живой вакцины против туляремийной инфекции (3). Штамм получен отбором стрептомицинрезистентных мутантов туляремийного микроба штамма B399 A-CoLe неарктического подвида.

Известно использование коллекции штаммов Francisella tularensis для сравнения при изучении биологических свойств, популяционной структуры возбудителя туляремии (4, 5).

В документах ВОЗ в качестве контрольного предлагается аттенуированный штамм Francisella tularensis ATCC 6223 (В-38), который рекомендован для сравнения при определении видовой принадлежности возбудителя, однако он не может быть применен в качестве контрольного при определении всех подвидов туляремии (6).

Для унифицирования, стандартизирования и обеспечения безопасности при проведении молекулярно-генитических исследований (ПЦР-анализ, биочипы) в лабораториях различного уровня (территориального, регионального, федерального) целесообразно использовать для контроля стерильные препараты ДНК, а не ДНК, полученную ex tempro из штаммов возбудителя туляремии.

Известны контрольные препараты к диагностическим наборам для выявления возбудителей Chlamydia trachomatis, Ureaplasma urealyticum, Micoplasma hominis и др. в люминесцентной микроскопии, выпускаемые различными фирмами, например, научно-производственной фирмой «Галарт», которые представляют собой приготовленный и зафиксированный мазок возбудителя инфекционных болезней. Контрольные препараты предназначены для проведения внутреннего контроля в лабораториях, выполняющих диагностические исследования и сравнительные испытания. Применение таких контрольных препаратов исключает необходимость хранить коллекцию живых возбудителей инфекционных болезней.

Известны контрольные препараты ДНК (маркеры молекулярного веса) для электрофореза в агарозном геле, которые используют для приблизительной оценки, путем сравнения интенсивности фрагментов одинакового размера, а также в качестве стандарта молекулярных весов (например, ДНК фага Лямбда) (7).

Наиболее близким по решению являются контрольные образцы ДНК и РНК, выпускаемые фирмой Vircell Microbiologists, которые представляют собой лиофилизированные образцы геномной ДНК и РНК патогенов, предназначенные для использования в качестве внешнего положительного контроля качественной и количественной ПЦР (8).

По проведенному патентному поиску и литературным данным в настоящее время сведений о наличии контрольных препаратов бактериальной ДНК возбудителя туляремии для молекулярно-генетических исследований не найдено.

Задача настоящего изобретения - набор референтных штаммов Francisella tularensis подвидов tularensis (тип A), holarctica (тип В) и mediasiatica стабильно сохраняющие фенотипические свойства, содержащие гены, нуклеотидная последовательность которых специфична для вида, подвида, биовара, и создание на их основе комплекта контрольных препаратов ДНК для генно-диагностических исследований.

Технический результат, полученный от использования изобретения, выражается в повышении эффективности диагностических исследований за счет внедрения контрольных препаратов, позволяющих использовать их в лабораториях любого уровня, в том числе, не имеющих возможности хранения штаммов возбудителей I-II групп патогенности, исключить технические ошибки при выполнении генетических методов, а также стандартизовать и повысить качество диагностических препаратов на этапах производства.

Для достижения указанного технического результата предложен набор референтных штаммов Francisella tularensis подвида tularensis, включающего две генетические группы AI и AII, подвида holarctica, включающего три биовара: Japonica, эритромицинчувствительный (Ery^s), эритромицинустойчивый (Ery^R) и подвида mediasiatica для генетических и иммунологических исследований, а также комплект препаратов ДНК из них для генно-диагностических исследований.

Заявляемые штаммы получены путем отбора клонов, стабильно сохраняющих фенотипические свойства и содержащих гены, нуклеотидная последовательность которых специфична для вида и подвида.

Характеристика штаммов:

Штамм Francisella tularensis подвида mediasiatica (А-61(117)) KM 4 - природный, выделен в Узбекистане (Каракалпакская АССР) в 1960 г. от иксодовых клещей, снятых с коров.

Культурально-морфологические признаки.

Кокки или коккобацилы мелкие, размером от 0,4 до 0,7 мкм. На FT агаре рН 7,2 через 24 ч формируют бесцветные или сероватые, гладкие с ровными краями колонии средней величины. В жидкой питательной среде - рост на поверхности среды.

Физиолого-биохимические признаки.

Аэроб. Оптимальная температура роста 37°С. Оптимум рН 7,0-7,4. Ауксотроф, требует присутствия в среде глюкозы, цистина (цистеина), витамина В. Не обладает пенициллиназной активностью. Обладает цитрулинуреидазной активностью. Ферментирует до кислоты без газа глицерин, не ферментирует D-мальтозу, D-глюкозу.

Штамм Francisella tularensis подвида mediasiatica агглютинируется видовой диагностической сывороткой

Особые свойства штамма.

Штамм Francisella tularensis KM 4 подвида mediasiatica содержит в геноме видоспецифичные гены ig IBC, острова патогенности FPI туляремийного микроба, область дифференциации RDI специфична для туляремийного микроба среднеазиатского подвида. Нуклеотидная последовательность фрагмента sdhA-гена размером 521 п.н. данного штамма идентична таковой у штаммов Francisella tularensis подвида mediasiatica FSC 147, полный геном которых представлен в базе данных NCBI Gen Bank (СР.000915.1). Имеет вариабельные на уровне подвида нуклеотиды: 80-«G», 96-«Т», 365-«Т» (нумерация нуклеотидов внутри фрагмента 521 п.н.).

Штамм Francisella tularensis подвида holarctica биовара Ery^s (21-Л) КМ 3-природный, выделен в Якутии в 1976 г. от лемминга.

Культурально-морфологические признаки.

Кокки или коккобацилы мелкие, размером от 0,6 до 0,7 мкм. На FT агаре рН 7,2 через 24 часа формируют бесцветные или сероватые, гладкие с ровными краями колонии средней величины. В жидкой питательной среде - рост на поверхности среды.

Физиолого-биохимические признаки.

Аэроб. Оптимальная температура роста 37°С. Оптимум рН 7,0-7,4. Ауксотроф, требует присутствия в среде глюкозы, цистина (цистеина), витамина В. Обладает пенициллиназной активностью, не обладает цитрулинуреидазной активностью, не ферментирует глицерин, ферментирует D-мальтозу, D-глюкозу.

Штамм Francisella tularensis подвида holarctica биовара Ery^s агглютинируется видовой диагностической сывороткой

Особые свойства штамма.

Штамм Francisella tularensis подвида holarctica биовара Ery^s KM 3 содержит в геноме видоспецифичные гены ig IBC острова патогенности FPI туляремийного микроба, область дифференциации RDI, специфичную для туляремийного микроба голарктического подвида биоваров Ery^s и Ery^R. Нуклеотидная последовательность фрагмента sdhA-гена размером 521 п.н. данного штамма идентична таковой у штаммов Francisella tularensis holarctica биоваров Ery^s и Ery^R LVS, OSU18, FTNF002-00, полный геном которых представлен в базе данных NCBI Gen Bank (AM 233362.1, СР.000437.1, СР.000803. 1). Имеет вариабельные на уровне подвида нуклеотиды: 80-«G», 96-«С», 365-«Т» (нумерация нуклеотидов внутри фрагмента 521 п.н.).

Штамм Francisella tularensis подвида holarctica биовара Ery^R (М-498) КМ 8 природный, выделен в Астраханской области в 1989 г. от обыкновенных полевок.

Культурально-морфологические признаки:

Кокки или коккобацилы мелкие, размером от 0,6 до 0,7 мкм. На FT агаре рН 7,2 через 24 часа формируют бесцветные или сероватые, гладкие с ровными краями колонии средней величины. В жидкой питательной среде - рост на поверхности среды.

Физиолого-биохимические признаки:

Аэроб. Оптимальная температура роста 37°С. Оптимум рН 7,0-7,4. Ауксотроф, требует присутствия в среде глюкозы, цистина (цистеина), витамина В. Обладает пенициллиназной активностью, не обладает цитрулинуреидазной активностью, не ферментирует глицерин, ферментирует D-мальтозу, D-глюкозу.

Штамм Francisella tularensis подвида holarctica биовара Егу^R агглютинируется видовой диагностической сывороткой

Особые свойства штамма:

Штамм Francisella tularensis подвида holarctica биовара Егу^R КМ содержит в геноме видоспецифичные гены ig IBC, острова патогенности FPI туляремийного микроба, область дифференциации RDI специфична для туляремийного микроба голарктического подвида биоваров Ery^s и Егу^R. Нуклеотидная последовательность фрагмента sdhA-гена размером 521 п.н. данного штамма идентична таковой у штаммов Francisella tularensis holarctica биоваров Ery^s и Ery^R LVS, OSU18, FTNF002-00, полный геном которых представлен в базе данных NCBI Gen Bank (AM 233362.1, CP 000437.1, CP 000803. 1). Имеет вариабельные на уровне подвида нуклеотиды: 80-«G», 96-«С», 365-«Т» (нумерация нуклеотидов внутри фрагмента 521 п.н.).

Штамм Francisella tularensis подвида holarctica биовара japonica (Kosho) KM 5 природный, выделен в Японии в 1973 г. от человека.

Культурально-морфологические признаки:

Кокки или коккобацилы мелкие, размером от 0,3 до 0,6 мкм. На FT агаре рН 7,2 через 24 часа формируют бесцветные или сероватые, гладкие с ровными краями колонии средней величины. В жидкой питательной среде - рост на поверхности среды.

Физиолого-биохимические признаки:

Аэроб. Оптимальная температура роста 37°С. Оптимум рН 7,0-7,4. Ауксотроф, требует присутствия в среде глюкозы, цистина (цистеина), витамина В. Обладает пенициллиназной активностью, не обладает цитрулинуреидазной активностью. Ферментирует до кислоты без газа глицерин, D-мальтозу, D-глюкозу.

Штамм Francisella tularensis подвида holarctica биовара japonica KM 5 агглютинируется видовой диагностической сывороткой

Особые свойства штамма:

Штамм Francisella tularensis подвида holarctica биовара japonica KM 5 содержит в геноме видоспецифичные гены ig IBC, острова патогенности FPI туляремийного микроба, область дифференциации RDI, специфичную для туляремийного микроба голарктического подвида японского биовара. Нуклеотидная последовательность фрагмента sdhA-гена размером 521 п.н. данного штамма идентична таковой у штаммов Francisella tularensis подвида holarctica, LVS, OSU18, FTNF002-00, полный геном которых представлен в базе данных NCBI Gen Bank (AM 233362.1 СР.000803.1). Имеет вариабельные на уровне подвида нуклеотиды: 80-«G», 96-«С», 365-«С» (нумерация нуклеотидов внутри фрагмента 521 п.н.).

Штамм Francisella tularensis подвида tularensis (0-328) KM 7 (генетическая группа AI) - природный, выделен от клещей в Канаде в 1935 г.

Культурально-морфологические признаки:

Кокки или коккобацилы мелкие, размером от 0,3 до 0,7 мкм. На FT агаре рН 7,2 через 24 часа формируют бесцветные или сероватые, гладкие с ровными краями колонии средней величины. В жидкой питательной среде - рост на поверхности среды.

Физиолого-биохимические признаки:

Аэроб. Оптимальная температура роста 37°С. Оптимум рН 7,0-7,4. Ауксотроф, требует присутствия в среде глюкозы, цистина (цистеина), витамина В. Обладает пенициллиназной и цитрулинуреидазной активностью, ферментирует до кислоты без газа глицерин, D-мальтозу, D-глюкозу.

Агглютинируется видовой диагностической сывороткой.

Особые свойства штамма:

Штамм Francisella tularensis подвид tularensis KM 7 (генетическая группа AI) содержит в геноме видоспецифичные гены ig IBC, острова патогенности FPI туляремийного микроба, область дифференциации RDI специфична для туляремийного микроба подвида tularensis. Нуклеотидная последовательность фрагмента sdhA-гена размером 521 п.н. данного штамма идентична таковой у штаммов Francisella tularensis subsp.tularensis SCHU S4, FSC198, полный геном которых представлен в базе данных NCBI Gen Bank (AJ 749949.2.AM 286280.1). Имеет вариабельные на уровне подвида нуклеотиды: 80-«А», 96-«С», 365-«Т» (нумерация нуклеотидов внутри фрагмента 521 п.н.).

Штамм Francisella tularensis подвида tularensis (Е-261(В.399) KM 6 (генетическая группа АН) - природный, выделен в США в 1972 г. от оленьей мухи.

Культурально-морфологические признаки:

Кокки или коккобацилы мелкие, размером от 0,3 до 0,7 мкм. На FT агаре рН 7,2 через 24 часа формируют бесцветные или сероватые, гладкие с ровными краями колонии средней величины. В жидкой питательной среде - рост на поверхности среды.

Физиолого-биохимические признаки:

Аэроб. Оптимальная температура роста 37°С. Оптимум рН 7,0-7,4. Ауксотроф, требует присутствия в среде глюкозы, цистина (цистеина), витамина В. Обладает пенициллиназной и цитрулинуреидазной активностью, ферментирует до кислоты без газа глицерин, D-мальтозу, D-глюкозу.

Агглютинируется видовой диагностической сывороткой.

Особые свойства штамма:

Штамм Francisella tularensis подвида tularensis KM 6 (генетическая группа АII) содержит в геноме видоспецифичные гены ig IBC, острова патогенности FPI туляремийного микроба, область дифференциации RDI специфична для туляремийного микроба подвида tularensis. Нуклеотидная последовательность фрагмента sdhA-гена размером 521 п.н. данного штамма идентична таковой у штаммов Francisella tularensis subsp.tularensis WY96-3418, полный геном которого представлен в базе данных NCBI Gen Bank (СР. 000608.1). Имеет вариабельные на уровне подвида нуклеотиды: 80-«G», 96-«С», 365-«Т» (нумерация нуклеотидов внутри фрагмента 521 п.н.).

Заявляемые штаммы Francisella tularensis депонированны в «Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб» (ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб»), где им присвоены номера:

Francisella tularensis подвида mediasiatica - KM 4

Francisella tularensis подвида holarctica биовара Ery^s - KM 3

Francisella tularensis подвида holarctica биовара Ery^R - KM 8

Francisella tularensis подвида holarctica биовара japonica - KM 5

Francisella tularensis подвида tularensis (генетическая группа AI) - KM 7

Francisella tularensis подвида tularensis (генетическая группа AII) - KM 6

Технический результат также достигается созданием комплекта препаратов ДНК из штаммов бактерий Francisella tularensis различных подвидов и биоваров для молекулярно-генетических исследований.

Препараты представляют собой высокоочищенную бактериальную геномную ДНК каждого подвида Francisella tularensis, полученную обработкой определенными ферментами с последующей фильтрационной очисткой. Полученные препараты скомпонованы в комплект, состоящий из пробирок и флаконов, содержащих:

- достаточное количество очищенной геномной ДНК штаммов бактерий Francisella tularensis подвида tularensis генетических групп AI и AII, взятых в равном соотношении;

- достаточное количество очищенной геномной ДНК штаммов бактерий Francisella tularensis подвида holarctica биовара Ery^s, биовара Ery^R, биовара japonica, взятых в равном соотношении;

- достаточное количество очищенной геномной ДНК штаммов бактерий Francisella tularensis подвида mediasiatica;

- достаточное количество очищенной геномной ДНК штамма бактерий Francisella tularensis подвида holarctica биовара japonica;

- достаточное количество очищенной геномной ДНК штамма бактерий Francisella tularensis подвида holarctica биовара Ery^s;

- достаточное количество очищенной геномной ДНК штамма бактерий Francisella tularensis подвида holarctica биовара Ery^R;

- достаточное количество очищенной геномной ДНК штамма бактерий Francisella tularensis подвида tularensis генетической группы AI;

- достаточное количество очищенной геномной ДНК штамма бактерий Francisella tularensis подвида tularensis генетической группы AII;

- разводящий буфер.

Комплект предназначен для выполнения генодиагностических исследований при определении подвида Francisella tularensis, для контролирования специфичности разрабатываемых тест-систем, для научных генетических исследований как положительный или отрицательный контроль.

Использование комплекта значительно облегчает выполнение молекулярно-генетических методов, обеспечивает их стандартизацию, повышает качество экспериментальных и диагностических исследований.

Заявляемая коллекция референтных штаммов Francisella tularensis различных подвидов и комплект препаратов из них могут быть использованы:

1) в качестве референтных штаммов, а также как исходных при создании комплекта контрольных препаратов ДНК из штаммов бактерий Francisella tularensis различных подвидов для генетических исследований;

2) в производстве ПЦР - тест-систем для идентификации возбудителя туляремии каждого подвида или набора праймеров для всех перечисленных выше подвидов в качестве положительного контроля;

3) в производстве ПЦР - тест-систем близкородственных микроорганизмов для исключения перекрестных реакций в качестве контроля;

4) для научных генетических исследований штаммов возбудителя туляремии при молекулярном типировании с помощью генамплификационных, рестрикционных и секвенационных технологий в качестве контрольных препаратов;

5) для оценки специфичности при разработке новых диагностических препаратов на основе олигонуклеотидных микрочипов (ДНК-чипов);

6) для внутреннего контроля качества диагностических исследований лицензированных лабораторий в качестве контрольных препаратов;

7) в качестве референтных штаммов бактерий Francisella tularensis различных подвидов для оценки специфичности, чувствительности и активности сывороток диагностических туляремийных и препаратов иммуноглобулинов диагностических туляремийных в иммунологических реакциях.

Пример 1. Определение принадлежности исследуемых культур к виду Francisella tularensis.

В соответствии с МУ 3.1.2007-05 (2) и Руководством ВОЗ (6) для идентификации выделенных штаммов туляремийного микроба предложено использование ПЦР с праймерами на основе гена 16S рДНК (специфичного на уровне рода Francisella) и генов tul4, fopA, ISFtu2, iglABCD (специфичные для вида Francisella tularensis).

Для исследования готовили взвесь 2 исследуемых штаммов туляремийного микроба, выращенных на плотной питательной среде, в 2 мл 0,9% стерильного раствора натрия хлорида по отраслевому стандартному образцу мутности 10 единиц ГИСК им. Л.А.Тарасевича (ОСО 42-28-59-85П), что соответствует 5×10⁹ м.к.мл. Затем делали 10-кратные разведения в 0,9% стерильном растворе натрия хлорида до конечной концентрации 1×10⁵ м.к./мл. Обеззараживание микробных взвесей осуществляли согласно МУ 1.3.2569-09 (9). К подготовленной бактериальной суспензии объемом 4,5 мл добавляли 0,5 мл из раствора натрия мертиолята 0,1% концентрации (разведение 1:1000) до конечной концентрации 0,01% (разведение 1:10000), прогревали при температуре 56°С в течение 30 мин. Затем отбирали по 0,1 мл бактериальной взвеси в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл и добавляли 300 мкл лизирующего раствора, содержащего 6 М гуанидинтиоцианат. Прогревали при температуре 65°С в течение 15 мин.

Выделение ДНК осуществляли с помощью набора для выделения ДНК - «ДНК-сорб В» (ИЛС, Россия) или любой другой фирмы. Работу выполняли в соответствии с инструкцией производителя.

Проведение ПЦР осуществляли в соответствии с руководством ВОЗ (2007) при использовании праймеров на основе 16S рДНК (F5-F11) (10) и с помощью экспериментальной генамплификационной тест-системы с праймерами на основе генов iglBC. В качестве положительного контроля использовали геномную ДНК штаммов бактерий Francisella tularensis подвида tularensis генетических групп AI и AII, взятых в равном соотношении.

Учет результатов осуществляли с помощью электрофореза. Амплифицированный продукт в объеме 10 мкл вносят в лунки 2% геля. Агарозный гель готовили на 1×ТАЕ с бромидом этидия, камеру для электрофореза заполняли аналогичным буфером. Электрофорез проводили в соответствии с инструкцией по эксплуатации источника питания в течение 20-25 мин, при градиенте напряжения 10 В/см. Краситель должен пройти 2/3 длины трека. После окончания процесса гель промывали в проточной воде и помещали на УФ-трансиллюминатор. Учет и документирование результатов осуществляли на гель-документирующей системе GelDoc (BioRad). Окрашенную ДНК в геле просматривают под ультрафиолетовым излучением, для чего используют трансиллюминатор с длиной волны в диапазоне 254-312 нм, фрагменты которой проявляются в виде светящихся розово-красных полос.

Интерпретация результатов. Результаты ПЦР-анализа оценивали по наличию или отсутствию на электрофореграмме специфической полосы амплифицированной ДНК на уровне, соответствующем полосе положительного контроля.

При проведении ПЦР с праймерами на основе 16S рДНК на электрофореграмме (фиг.1) были зафиксированы следующие фрагменты:

Проба 1. Исследуемый штамм №1 - фрагмент размером 1104 п.н.

Проба 2. Исследуемый штамм №2 - фрагмент размером 1104 п.н.

Проба 3. Положительный контроль (геномная ДНК штаммов бактерий Francisella tularensis подвида tularensis генетических групп AI и AII) - фрагмент размером 1104 п.н.

Проба 4. Отрицательный контроль - фрагмент отсутствует.

Полученные результаты указывают на принадлежность исследованных штаммов №1 и №2 роду Francisella.

При проведении ПЦР с праймерами на основе iglBC генов на электрофореграмме (фиг.1) были зафиксированы следующие фрагменты:

Проба 1. Исследуемый штамм №1 - фрагмент размером 268 п.н.

Проба 2. Исследуемый штамм №2 - фрагмент размером 268 п.н.

Проба 3. Положительный контроль (геномная ДНК штаммов бактерий Francisella tularensis подвида tularensis генетических групп AI и AII) - фрагмент размером 268 п.н.

Проба 4. Отрицательный контроль - фрагмент отсутствует.

Полученные результаты указывают на принадлежность исследованных штаммов №1 и №2 виду Francisella tularensis.

Пример 2. Определение подвидовой принадлежности туляремийного микроба методом ПЦР.

В соответствии с Руководством ВОЗ (6) для определения подвидов туляремийного микроба методом ПЦР в качестве ДНК-мишеней используют участки Ft-M19, ISFtu2, pdpD, RD1.

Подготовку проб бактериальных суспензий 2 исследуемых штаммов туляремийного микроба осуществляли аналогично как в примере 1, доводя концентрацию микробных клеток в 1 мл до 1×10⁷. Обеззараживание проб и выделение ДНК проводили аналогично как в примере 1.

Для выявления RD1 области использовали олигуклеотидные праймеры, предложенные Broekhuijsen et al. [11]:

RD1-F 5' - TTTATATAGGTAAATGTTTTACCTGTACCA-3'

RD1-R5' - GCCGAGTTTGATGCTGAAAA-3'.

Для проведения ПЦР готовили 7 микропробирок объемом 0,6 мл. В отдельной микропробирке объемом 0,6 мл готовили общую реакционную смесь, исходя из того, что на 1 пробу требуется: 10×Б - 2,5 мкл, 50 мМ раствор MgCl₂ - 1,5 мкл, 25 мМ раствор дНТФ - 0,2 мкл, праймеры RD1-F и RD1-R в концентрации 100 пкмоль/мкл - по 0,15 мкл каждого, фермент Taq-ДНК-полимераза с активностью 5 ед/мкл - 0,4 мкл, вода свободная от нуклеаз (путем фильтрации) - 5,6 мкл, конечный объем - 15 мкл. Реакционную смесь тщательно перемешивали на микроцентрифуге встряхивателе и переносили по 15 мкл в подготовленные пробирки. Сверху наслаивали по 20-25 мкл минерального парафинового масла. После этого отдельными наконечниками с фильтрами в первые две пробирки вносили по 10 мкл ДНК исследуемых культур F. tularensis. Затем в последнюю пробирку вносили 10 мкл воды, свободной от нуклеаз - отрицательный контроль. После этого в пробирки 3-6 вносили по 10 мкл препаратов ДНК туляремийного микроба различных подвидов - положительный контроль. В качестве положительного контроля использовали геномную ДНК штаммов бактерий Francisella tularensis подвида tularensis генетических групп AI и АII, взятых в равном соотношении (3-ая пробирка), геномную ДНК штамма бактерии Francisella tularensis подвида mediasiatica (4-ая пробирка), геномную ДНК штамма бактерии Francisella tularensis подвида holarctica биовара japonica (5-ая пробирка), геномную ДНК штаммов бактерий Francisella tularensis подвида holarctica биоваров Ery^s и Ery^R, взятых в равном соотношении (6-ая пробирка). Пробирки помещали в амплификатор и проводили реакцию по следующей программе: 95°С - 10 мин; 30 циклов из 94°С - 30 с, 60°С - 1 мин, 72°С - 1 мин; 72°С - 3 мин.

Учет результатов осуществляли с помощью электрофореза. Амплифицированный продукт в объеме 10 мкл смешивали с 2 мкл лидирующего красителя (например, 6×Orange DNA Loading Dye, Fermentas, кат № R0631) и вносили в лунки 3% агарозного геля NuSieve 3:1. Агарозный гель готовили на 1×TAE с бромидом этидия, камеру для электрофореза заполняли аналогичным буфером. Электрофорез проводили в соответствии с инструкцией по эксплуатации источника питания в течение 2,5-3 ч, при градиенте напряжения 5 В/см. После окончания процесса гель промывали в проточной воде и помещали на УФ-трансиллюминатор. Учет и документирование результатов осуществляли на гель-документирующей системе GelDoc (BioRad). Окрашенную ДНК в геле просматривают под ультрафиолетовым излучением, для чего используют трансиллюминатор с длиной волны в диапазоне 254-312 нм, фрагменты которой проявляются в виде светящихся розово-красных полос.

Интерпретация результатов. Результаты ПЦР-анализа оценивали по наличию или отсутствию на электрофореграмме специфической полосы амплифицированной ДНК на уровне соответствующих полос положительных контролей.

При проведении ПЦР с праймерами RD1-F и RD1-R, фланкирующми RD1 - область туляремийного микроба, были зафиксированы следующие фрагменты (фиг.2):

Проба 1. Исследуемый штамм №1 - фрагмент размером 924 п.н.

Проба 2. Исследуемый штамм №2 - фрагмент размером 1522 п.н.

Проба 3. Положительный контроль - геномная ДНК штаммов бактерий Francisella tularensis подвида tularensis генетических групп AI и AII - фрагмент размером 1522 п.н.

Проба 4. Положительный контроль - геномная ДНК штамма бактерии Francisella tularensis подвида mediasiatica - фрагмент размером 1453 п.н.

Проба 5. Положительный контроль - геномная ДНК штамма бактерии Francisella tularensis подвида holarctica биовара japonica - фрагмент размером 1136 п.н.

Проба 6. Положительный контроль - геномная ДНК штаммов бактерий Francisella tularensis подвида holarctica биоваров Ery^s и Ery^R, взятых в равном соотношении -фрагмент размером 924 п.н.

Проба 7. Отрицательный контроль - фрагменты отсутствуют.

Полученные результаты указывают на принадлежность исследованного штамма №1 к Francisella tularensis подвида holarctica биоваров Ery^s и Ery^R, штамма №2 - к Francisella tularensis подвида tularensis.

Пример 3. Использование референтных штаммов туляремийного микроба различных подвидов для оценки специфичности экспериментальной тест-системы для выявления ДНК Y.pestis методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов в режиме реального времени.

Для исследования использовали экспериментальную тест-систему для выявления ДНК Y.pestis методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов в режиме реального времени с праймерами на основе видоспецифичного фрагмента хромосомы возбудителя чумы. Для оценки чувствительности и специфичности тест-системы использовали бактериальные суспензии Y. pestis EV с концентрацией 1×10⁴-1×10² м.к./мл и F.tularensis подвида tularensis генетической группы AI с концентрацией 1×10⁷ м.к./мл. Подготовку проб, их обеззараживание и выделение ДНК осуществляли так же, как в примере 1. Постановку ПЦР и учет результатов проводили в соответствии с инструкцией к препарату.

Наличие специфической флуоресценции отмечено только при исследовании проб, содержащих ДНК чумного микроба по каналу JOE (фиг.4). При исследовании пробы, содержащей ДНК F.tularensis подвида tularensis генетической групп AI, получен отрицательный результат. Представленные данные указывают на специфичность разработанной экспериментальной тест-системы для выявления ДНК Y.pestis методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов в режиме реального времени.

Пример 4. Определение принадлежности возбудителя туляремии к подвиду, биовару и генетической группе с помощью секвенирования фрагмента sdhA-гена.

Подготовку бактериальной суспензии, обеззараживание материала и выделение ДНК осуществляли так же, как описано в примере 1. Для исследования использовали бактериальную суспензию штаммов туляремийного микроба с концентрацией 1×10⁷ м.к./мл. Для анализа проводили первичную ПЦР с праймерами, фланкирующими 521 п.н. фрагмент sdhA гена. Секвенирование ампликонов, полученных в ПЦР, выполняли на автоматическом секвенаторе «АВ1 PRISM 3100 Genetic Analiser» или любой другой фирмы. Подготовку проб для секвенирования осуществляли в соответствии с рекомендациями производителя. В качестве контрольных образцов для сравнения нуклеотидных последовательностей использовали референтные штаммы Francisella tularensis подвида tularensis генетических групп AI и AII, подвида holarctica биоваров Ery^S и Ery^R и japonica и подвида mediasiatica или препараты геномной ДНК из них. Результаты оценивали с помощью генетических программ (например, Mega 4.1) путем выравнивая нуклеотидных последовательностей и сравнения нуклеотидного состава у исследуемых штаммов и референтных штаммов туляремийного микроба различных подвидов, биоваров и генетических групп. Исследуемые культуры F.tularensis относятся к подвиду tularensis генетических групп AI и AII при 100% гомологии изученного фрагмента sdhA гена с таковым у референтных штаммов F.tularensis подвида tularensis генетических групп AI и AII. Исследуемые культуры F.tularensis относятся к подвиду mediasiatica при 100% гомологии изученного фрагмента sdhA гена с таковым у референтного штамма F.tularensis подвида mediasiatica. Исследуемые культуры F.tularensis относятся к подвиду holarctica биоварам Ery^s и Ery^R при 100% гомологии изученного фрагмента sdhA гена с таковым у референтных штаммов F.tularensis подвида holarctica биоварам Ery^s и Ery^R. Исследуемые культуры F.tularensis относятся к подвиду holarctica биовару japonica при 100% гомологии изученного фрагмента sdhA гена с таковым референтного штамма F.tularensis подвида holarctica биовара japonica.

Пример 5. Оценка специфичности диагностических тест-систем на основе олигонуклеотидных микрочипов (ДНК-чипов).

Многопараметрический анализ на биочипах, с использованием референс-штаммов F.tularensis или комплекта препаратов геномной ДНК из них, включает следующие этапы: приготовление пробы для анализа, проведение асимметричной мультиплексной ПЦР (амПЦР), гибридизация на биологическом микрочипе, учет результатов анализа.

Подготовку штаммов (анализируемых и референс) проводят в соответствии с МУ 1.3.2569-09 (9).

Выделение ДНК для последующего ПЦР-анализа осуществляют с помощью набора для выделения ДНК в соответствии с инструкцией производителя.

Амплификацию выделенной ДНК осуществляют аналогично описанной выше (пример 1). При этом в реакционной смеси используют флуоресцентно-меченый обратный праймер в концентрации, превышающей концентрацию прямого праймера в 5-10 раз. Амплификацию проводят в соответствии с инструкцией к набору реагентов.

В необходимое количество микроцентрифужных пробирок микродозатором вносят по 15 мкл гибридизационного буфера (4^х раствор SSC, 0,1% ДСН) и 15 мкл водной фазы ПЦР-смеси, полученной в результате проведения амПЦР, перемешивают в течение 20-30 c на вортексе с частотой вращения не менее 1500 мин^-1 для получения гибридизационной смеси. Денатурацию ДНК осуществляют в течение 5 мин при 94°С с последующим охлаждением на льду. Из каждой микроцентрифужной пробирки микродозатором отбирают по 30 мкл гибридизационной смеси и всю смесь вносят в ячейку инкубационной камеры на поверхность биологического микрочипа с иммобилизованными специфическими зондами, отверстия инкубационной камеры заклеивают пленкой для микропланшет. Гибридизацию проводят в термостате при температуре 37°С в течение 18 ч. После окончания гибридизации инкубационную камеру снимают, каждый биологический микрочип трижды промывают дистиллированной водой при температуре 25°С и высушивают центрифугированием при 1000 мин^-1 5 мин.

Визуализацию гибридизационной картины на биологическом микрочипе осуществляют с помощью флуоресцентного сканера для биочипов. Суждение о принадлежности анализируемого штамма к определенному подвиду возбудителя туляремии выносят на основании регистрации гибридизации с соответствующим зондом (зондами). При этом гибридизационная картина анализируемого штамма и референс-штаммов или контрольных препаратов геномной ДНК из них должна соответствовать картине в рамках подвидов, к которым они принадлежат (специфичность 100%).

Пример 6. Идентификация штаммов возбудителя туляремии с использованием олигонуклеотидных биочипов.

Референс-штаммы F.tularensis или комплект препаратов геномной ДНК используют в качестве положительного контроля при идентификации штаммов возбудителя туляремии на олигонуклеотидных биочипах.

Все этапы анализа на олигонуклеотидных биочипах проводят так же, как описано выше (пример 4). Гибридизационную картину анализируемой пробы сравнивают с гибридизационной картиной референс-штаммов или препаратов геномной ДНК и определяют принадлежность анализируемого штамма к определенному подвиду возбудителя туляремии.

Пример 7. Оценка внутреннего контроля качества комплекта реагентов для определения принадлежности культур к виду Francisella tularensis и роду Francisella методом ПЦР в соответствии с рекомендациями ВОЗ.

Для проведения исследований были подготовлены два комплекта реагентов с праймерами на основе 16S рДНК (F5-F11), рекомендованными Руководством по туляремии ВОЗ (6). Для оценки чувствительности ПЦР с данными комплектами использовали бактериальные суспензии референтного штамма F. tularensis подвида tularensis генетической группы AI с концентрацией 1×l0⁵-1×10^{3 м}.к./мл. Подготовку проб к их обеззараживанию осуществляли так же, как описано в примере 1. Выделение ДНК, постановку ПЦР и учет результатов осуществляли аналогично, как в примере 1. Электрофорез в агарозном геле проводили так же, как описано в примере 2.

При проведении ПЦР с двумя комплектами реагентов с праймерами на основе 16S рДНК на электрофореграмме (фиг.3) были зафиксированы следующие фрагменты:

Проба 1. F.tularensis подвида tularensis генетической группы AI в концентрации 1×10⁵ м.к./мл (1-ый комплект) - фрагмент размером 1104 п.н.

Проба 2. F.tularensis подвида tularensis генетической группы AI в концентрации 1×10⁴ м.к./мл (1-ый комплект) - фрагмент размером 1104 п.н.

Проба 3. F.tularensis подвида tularensis генетической группы AI в концентрации 1×10³ м.к./мл (1-ый комплект) - результат сомнительный.

Проба 4. Отрицательный контроль - фрагмент отсутствует.

Проба 5. F.tularensis подвида tularensis генетической группы AI в концентрации 1×10⁵ м.к./мл (2-ой комплект) - фрагмент размером 1104 п.н.

Проба 6. F.tularensis подвида tularensis генетической группы AI в концентрации 1×10⁴ м.к./мл (2-ой комплект) - фрагмент размером 1104 п.н.

Проба 7. F.tularensis подвида tularensis генетической группы AI в к