Ингибиторы тирозинкиназ

Ингибиторы тирозинкиназ

Реферат

Изобретение относится к новым замещенным пиримидиниламинобензамидам, способам их получения, содержащим их фармацевтическим композициям, применению их необязательно в комбинации с одним или несколькими другими фармацевтически активными соединениями для лечения заболевания, которое связано с ингибированием активности протеинкиназы, особенно опухолевого заболевания, в частности лейкемии, и способу лечения такого заболевания.

Уровень техники

Протеинкиназы (PK) являются ферментами, которые катализируют фосфорилирование специфических остатков серина, треонина или тирозина в клеточных белках. Эти посттрансляционные модификации субстратных белков действуют в качестве молекулярных выключателей, регулирующих клеточную пролиферацию, активацию и/или дифференциацию. Отклоненная от нормы или избыточная активность PK наблюдается для многих заболеваний, включая доброкачественные и злокачественные пролиферативные заболевания. В ряде случаев излечение заболеваний, таких как пролиферативные заболевания, возможно благодаря применению ингибиторов PK in vitro и in vivo.

Ввиду большого количества ингибиторов протеинкиназы и множества пролиферативных и других связанных с PK заболеваний все еще существует необходимость получения новых классов соединений, которые будут полезны в качестве ингибиторов PK и, следовательно, для лечения этих связанных с PTK заболеваний. Это обеспечивается новыми классами фармацевтически полезных ингибирующих PK соединений.

Филадельфийская хромосома является признаком хронической миелогенной лейкемии (CML) и несет гибридный ген, который содержит N-терминальные экзоны bcr гена и главную С-терминальную часть (экзоны 2-11) с-abl гена. Продуктом гена является белок 210 кДа (р210 Bcr-Abl). Abl-часть белка Bcr-Abl содержит abl-тирозинкиназу, которая сильно регулируется с-abl дикого типа, но изначально активируется в слитом белке Bcr-Abl. Эта нерегулируемая тирозинкиназа взаимодействует с многочисленными клеточными сигналами, приводя к трансформации и нарушению регулирования пролиферации клеток (Lugo и др., Science 247, 1079 [1990]).

Общее описание изобретения

Было обнаружено, что различные соединения класса пиримидиниламинобензамидов проявляют ингибирование активности протеинкиназы. Соединения формулы I, описанные далее более подробно, особенно проявляют ингибирование одной или нескольких тирозинкиназ, таких как с-Abl, Bcr-Abl, рецептора тирозинкиназ PDGF-RFlt3, VEGF-R, EGF-R и с-Kit, а также комбинаций двух или нескольких из них; в случае новых пиримидиниламинобензамидов в соответствии с изобретением соединения подходят для ингибирования этих и/или других протеинкиназ, особенно протеинкиназ, упомянутых выше, и/или для ингибирования мутантов этих ферментов, особенно Bcr-Abl, например мутанта Glu255 -> валин. Благодаря этой активности соединения могут использоваться для лечения заболеваний, связанных особенно с отклоненной от нормы или избыточной активностью таких типов киназ, особенно упомянутых выше.

Подробное описание изобретения

Изобретение относится к соединению формулы I

где

R₁ представляет собой водород, низший алкил, низший алкокси-низший алкил, ацилокси-низший алкил, карбокси-низший алкил, низший алкоксикарбонил-низший алкил или фенил-низший алкил;

R₂ представляет собой водород, низший алкил, необязательно замещенный одним или несколькими одинаковыми или различными радикалами R₃, циклоалкил, бензциклоалкил, гетероциклил, арильную группу или моно- или бициклическую гетероарильную группу, включающую ноль, один, два или три кольцевых атома азота и ноль или один атом кислорода и ноль или один атом серы, где группы в каждом случае являются незамещенными или моно- или полизамещенными;

и R₃ представляет собой гидрокси, низший алкокси, ацилокси, карбокси, низший алкоксикарбонил, карбамоил, N-моно- или N,N-дизамещенный карбамоил, амино, моно- или дизамещенный амино, циклоалкил, гетероциклил, арильную группу или моно- или бициклическую гетероарильную группу, включающую ноль, один, два или три кольцевых атома азота и ноль или один атом кислорода и ноль или один атом серы, где группы в каждом случае являются незамещенными или моно- или полизамещенными;

или где R₁ и R₂ вместе представляют собой алкилен с четырьмя, пятью или шестью атомами углерода, необязательно моно- или дизамещенный низшим алкилом, циклоалкилом, гетероциклилом, фенилом, гидрокси, низшим алкокси, амино, моно- или дизамещенным амино, оксо, пиридилом, пиразинилом или пиримидинилом; бензалкилен с четырьмя или пятью атомами углерода; оксаалкилен с одним атомом кислорода и тремя или четырьмя атомами углерода; или азаалкилен с одним атомом азота и тремя или четырьмя атомами углерода, где атом азота является незамещенным или замещен низшим алкилом, фенил-низшим алкилом, низший алкоксикарбонил-низшим алкилом, карбокси-низшим алкилом, карбамоил-низшим алкилом, N-моно- или N,N-дизамещенный карбамоил-низшим алкилом, циклоалкилом, низшим алкоксикарбонилом, карбокси, фенилом, замещенным фенилом, пиридинилом, пиримидинилом или пиразинилом;

R₄ представляет собой водород, низший алкил или галоген;

и N-оксид или фармацевтически приемлемая соль такого соединения.

Используемые здесь и далее общие термины в контексте данного описания имеют, предпочтительно, следующие значения, если не указано иное.

Термин "низший" обозначает радикал, имеющий включительно до 7, особенно включительно до 4 атомов углерода, эти радикалы являются линейными или разветвленными с одним или несколькими ветвлениями.

При использовании множественной формы соединения, соли и т.д. она обозначает также форму единственного числа соединение, соль или им подобные.

Любые асимметричные атомы углерода могут присутствовать в (R)-, (S)- или (R,S)-конфигурации, предпочтительно в (R)- или (S)-конфигурации. Соединения могут такими образом присутствовать в виде смеси изомеров или в виде чистых изомеров, предпочтительно в виде энантиомерно чистых диастереомеров.

Изобретение также относится к возможным таутомерам соединений формулы I.

Низший алкил предпочтительно представляет собой алкил с 1-7 включительно, предпочтительно с 1-4 включительно атомами углерода, и является линейным или разветвленным; предпочтительно, низший алкил представляет собой бутил, такой как н-бутил, втор-бутил, изобутил, трет-бутил, пропил, такой как н-пропил или изопропил, этил или метил. Предпочтительно низший алкил представляет собой метил, пропил или трет-бутил.

Низший ацил предпочтительно представляет собой формил или низший алкилкарбонил, в частности ацетил.

Арильная группа представляет собой ароматический радикал, который присоединяется к молекуле через связь с атомом углерода ароматического кольца этого радикала. В предпочтительном варианте осуществления арил представляет собой ароматический радикал, имеющий 6-14 атомов углерода, особенно фенил, нафтил, тетрагидронафтил, флуоренил или фенантренил, и является незамещенным или замещенным одним или несколькими, предпочтительно до трех, особенно одним или двумя заместителями, особенно выбранными из амино, моно- или дизамещенного амино, галогена, низшего алкила, замещенного низшего алкила, низшего алкенила, низшего алкинила, фенила, гидрокси, этерифицированного гидрокси, нитро, циано, карбокси, этерифицированного или эстерифицированного карбокси, алканоила, бензоила, карбамоила, N-моно- или N,N-дизамещенного карбамоила, амидино, гуанидино, уреидо, меркапто, сульфо, низшего алкилтио, фенилтио, фенил-низшего алкилтио, низшего алкилфенилтио, низшего алкилсульфинила, фенилсульфинила, фенил-низшего алкилсульфинила, низшего алкилфенилсульфинила, низшего алкилсульфонила, фенилсульфонила, фенил-низшего алкилсульфонила, низшего алкилфенилсульфонила, галоген-низшего алкилмеркапто, галоген-низшего алкилсульфонила, такого как особенно трифторметансульфонила, дигидроксибора (-В(ОН)₂), гетероциклила и низший алкилен-диоксисвязанного на соседних С-атомах кольца, такого как метилендиокси. Арил наиболее предпочтительно представляет собой фенил, нафтил или тетрагидронафтил, которые в каждом случае являются незамещенными или независимо замещены одним или двумя заместителями, выбранными из группы, включающей галоген, особенно фтор, хлор или бром; гидрокси; гидрокси, этерифицированный низшим алкилом, например метилом, галоген-низшим алкилом, например трифторметилом, или фенилом; низший алкилен-диоксисвязанный с двумя соседними С-атомами, например метилендиокси, низший алкил, например метил или пропил; галоген-низший алкил, например трифторметил; гидрокси-низший алкил, например гидроксиметил или 2-гидрокси-2-пропил; низший алкокси-низший алкил; например метоксиметил или 2-метоксиэтил; низший алкоксикарбонил-низший алкил, например метоксикарбонилметил; низший алкинил, такой как 1-пропинил; этерифицированный карбокси, особенно низший алкоксикарбонил, например метоксикарбонил, н-пропоксикарбонил или изопропоксикарбонил; N-моно-замещенный карбамоил, в частности карбамоил, монозамещенный низшим алкилом, например метил, н-пропил или изопропил; амино; низший алкиламино, например метиламино; динизший алкиламино, например диметиламино или диэтиламино; низший алкилен-амино, например пирролидино или пиперидино; низший оксаалкилен-амино, например морфолино, низший азаалкилен-амино, например пиперазино, ациламино, например ацетиламино или бензоиламино; низший алкилсульфонил, например метилсульфонил; сульфамоил; или фенилсульфонил.

Циклоалкильная группа предпочтительно представляет собой циклопропил, циклопентил, циклогексил или циклогептил и может быть незамещенной или замещенной одним или несколькими, особенно одним или двумя заместителями, выбранными из определенной выше группы для заместителей арила, наиболее предпочтительно низшим алкилом, таким как метил, низшим алкокси, таким как метокси или этокси, или гидрокси, а также оксо, или конденсирована с бензольным кольцом, так как в бензциклопентиле или бензциклогексиле.

Замещенный алкил представляет собой алкил, как определено выше, особенно низший алкил, предпочтительно метил; где может присутствовать один или несколько, особенно до трех, заместителей из группы, выбранной из галогена, особенно фтора, амино, N-низшего алкиламино, N,N-динизшего алкиламино, N-низшего алканоиламино, гидрокси, циано, карбокси, низшего алкоксикарбонила и фенил-низшего алкоксикарбонила. Трифторметил является особенно предпочтительным.

Моно- или дизамещенный амино особенно представляет собой амино, замещенный одним или двумя радикалами, независимо выбранными из низшего алкила, такого как метил; гидрокси-низшего алкила, такого как 2-гидроксиэтил; фенил-низшего алкила, такого как бензил или 2-фенилэтил; низшего алканоила, такого как ацетил; бензоила; замещенного бензоила, где фенильный радикал является, в частности, замещенным одним или несколькими, предпочтительно одним или двумя заместителями, выбранными из нитро, амино, галогена, N-низшего алкиламино, N,N-динизшего алкиламино, гидрокси, циано, карбокси, низшего алкоксикарбонила, низшего алканоила и карбамоила; и фенил-низшего алкоксикарбонила, где фенильный радикал является незамещенным или особенно замещен одним или несколькими, предпочтительно одним или двумя заместителями, выбранными из нитро, амино, галогена, N-низшего алкиламино, N,N-динизшего алкиламино, гидрокси, циано, карбокси, низшего алкоксикарбонила, низшего алканоила и карбамоила; и, предпочтительно, представляет собой N-низший алкиламино, такой как N-метиламино, гидрокси-низший алкиламино, такой как 2-гидроксиэтиламино, фенил-низший алкиламино, такой как бензиламино, N,N-динизший алкиламино, N-фенил-низший алкил-N-низший алкиламино, N,N-динизший алкилфениламино, низший алканоиламино, такой как ацетиламино, или заместитель, выбранный из группы, включающей бензоиламино и фенил-низший алкоксикарбониламино, где фенильный радикал в каждом случае является незамещенным или особенно замещенным нитро или амино, или также галогеном, амино, N-низшим алкиламино, N,N-динизшим алкиламино, гидрокси, циано, карбокси, низшим алкоксикарбонилом, низшим алканоилом, карбамоилом или аминокарбониламино. Дизамещенный амино также представляет собой низший алкилен-амино, например пирролидино, 2-оксопирролидино или пиперидино; низший оксаалкиленамино, например морфолино, или низший азаалкиленамино, например пиперазино или N-замещенный пиперазино, такой как N-метилпиперазино или N-метоксикарбонилпиперазино.

Галоген представляет собой особенно фтор, хлор, бром, или йод, особенно фтор, хлор или бром.

Этерифицированный гидрокси представляет собой особенно C₈-С₂₀алкилокси, такой как н-децилокси, низший алкокси (предпочтительно), такой как метокси, этокси, изопропилокси или трет-бутилокси, фенил-низший алкокси, такой как бензилокси, фенилокси, или галоген-низший алкокси, такой как трифторметокси, 2,2,2-трифторэтокси или 1,1,2,2-тетрафторэтокси.

Эстерифицированный гидрокси представляет собой особенно низший алканоилокси, бензоилокси, низший алкоксикарбонилокси, такой как трет-бутоксикарбонилокси или фенил-низший алкоксикарбонилокси, такой как бензилоксикарбонилокси.

Эстерифицированный карбокси представляет собой особенно низший алкоксикарбонил, такой как трет-бутоксикарбонил, изопропоксикарбонил, метоксикарбонил или этоксикарбонил, фенил-низший алкоксикарбонил или фенилоксикарбонил.

Алканоил представляет собой прежде всего алкилкарбонил, особенно низший алканоил, например ацетил.

N-Моно- или N,N-дизамещенный карбамоил особенно замещен одним или двумя заместителями, независимо выбранными из низшего алкила, фенил-низшего алкила и гидрокси-низшего алкила, или низшего алкилена, окса-низшего алкилена или аза-низшего алкилена, необязательно замещенного на конечном атоме азота.

Моно- или бициклическая гетероарильная группа, включающая ноль, один, два или три атома азота в кольце и ноль или один атом кислорода и ноль или один атом серы, где группы в каждом случае являются незамещенными или моно- или полизамещенными, обозначает гетероциклическую группу, которая является ненасыщенной в кольце, связывающем гетероарильный радикал с остатком молекулы формулы I, и предпочтительно представляет собой кольцо, в связывающем кольце, но необязательно также в любом нелинейном кольце, по крайней мере один атом углерода замещен гетероатомом, выбранным из группы, состоящей из азота, кислорода и серы; где связывающее кольцо предпочтительно имеет 5-12, наиболее предпочтительно 5 или 6 атомов в кольце; и которое может быть незамещенным или замещенным одним или несколькими, особенно одним или двумя заместителями, выбранными из группы, определенной выше для заместителей арила, наиболее предпочтительно низшим алкилом, таким как метил, низшим алкокси, таким как метокси или этокси, или гидрокси. Предпочтительно моно- или бициклическая гетероарильная группа выбрана из 2Н-пирролила, пирролила, имидазолила, бензимидазолила, пиразолила, индазолила, пуринила, пиридила, пиразинила, пиримидинила, пиридазинила, 4Н-хинолизинила, изохинолила, хинолила, фталазинила, нафтиридинила, хиноксалила, хиназолинила, хиннолинила, птеридинила, индолизинила, 3Н-индолила, индолила, изоиндолила, оксазолила, изоксазолила, тиазолила, изотиазолила, триазолила, тетразолила, фуразанила, бензо[d]пиразолила, тиенила и фуранила. Наиболее предпочтительно моно- или бициклическая гетероарильная группа выбрана из группы, состоящей из пирролила, имидазолила, такого как 1Н-имидазол-1-ил, бензимидазолила, такого как 1-бензимидазолил, индазолила, особенно 5-индазолила, пиридила, особенно 2-, 3- или 4-пиридила, пиримидинила, особенно 2-пиримидинила, пиразинила, изохинолинила, особенно 3-изохинолинила, хинолинила, особенно 4- или 8-хинолинила, индолила, особенно 3-индолила, тиазолила, бензо[d]пиразолила, тиенила и фуранила. В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения пиридильный радикал замещен гидрокси в орто-положении к атому азота и, следовательно, существует, по крайней мере частично, в форме соответствующего таутомера, который представляет собой пиридин-(1Н)2-он. В другом предпочтительном варианте осуществления пиримидинильный радикал замещен гидрокси в положениях 2 и 4 и, следовательно, существует в нескольких таутомерных формах, например в виде пиримидин-(1Н,3Н)2,4-диона.

Гетероциклил представляет собой особенно пяти-, шести- или семичленную гетероциклическую систему с одним или двумя гетероатомами, выбранными из группы, включающей азот, кислород и серу, которая может быть ненасыщенной или полностью или частично насыщенной, и является незамещенной или замещенной особенно низшим алкилом, таким как метил, фенил-низшим алкилом, таким как бензил, оксо или гетероарилом, таким как 2-пиперазинил; гетероциклил представляет собой особенно 2- или 3-пирролидинил, 2-оксо-5-пирролидинил, 4-пиперидинил, N-бензил-4-пиперидинил, 2- или 3-морфолинил, 2-оксо-1Н-азепин-3-ил, 2-тетрагидрофуранил или 2-метил-1,3-диоксолан-2-ил.

Соли представляют собой особенно фармацевтически приемлемые соли соединений формулы I.

Такие соли получают, например, в виде кислотных аддитивных солей, предпочтительно с органическими или неорганическими кислотами, из соединений формулы I с основным атомом азота, особенно фармацевтически приемлемых солей. Подходящими неорганическими кислотами являются, например, галогенсодержащие кислоты, такие как соляная кислота, серная кислота или фосфорная кислота. Подходящими органическими кислотами являются, например, карбоновые, фосфорные, сульфоновые или сульфамовые кислоты, например уксусная кислота, пропановая кислота, октановая кислота, декановая кислота, додекановая кислота, гликолевая кислота, молочная кислота, фумаровая кислота, янтарная кислота, адипиновая кислота, пимелиновая кислота, субериновая кислота, азелаиновая кислота, яблочная кислота, винная кислота, лимонная кислота, аминокислоты, такие как глутаминовая кислота или аспарагиновая кислота, малеиновая кислота, гидроксималеиновая кислота, метилмалеиновая кислота, циклогексанкарбоновая кислота, адамантанкарбоновая кислота, бензойная кислота, салициловая кислота, 4-аминосалициловая кислота, фталиевая кислота, фенилуксусная кислота, миндальная кислота, коричная кислота, метан- или этансульфоновая кислота, 2-гидроксиэтансульфоновая кислота, этан-1,2-дисульфоновая кислота, бензолсульфоновая кислота, 2-нафталенсульфоновая кислота, 1,5-нафталендисульфоновая кислота, 2-, 3- или 4-метилбензолсульфоновая кислота, метилсерная кислота, этилсерная кислота, додецилсерная кислота, N-циклогексилсульфамовая кислота, N-метил-, N-этил- или N-пропилсульфамовая кислота или другие органические протонные кислоты, такие как аскорбиновая кислота.

В присутствии отрицательно заряженных радикалов, таких как карбокси или сульфо, соли могут также получаться с основаниями, например соли с металлом или аммонием, такие как соли с щелочным металлом или щелочноземельным металлом, например соли с натрием, калием, магнием или кальцием, или аммониевые соли с аммонием или подходящими органическими аминами, такими как третичные моноамины, например триэтиламин или три(2-гидроксиэтил)амин, или гетероциклическими основаниями, например N-этилпиперидин или N,N'-диметилпиперазин.

Когда в одной молекуле присутствует и основная группа, и кислотная группа, соединение формулы I может также образовывать внутренние соли.

Для выделения или очистки также возможно применение фармацевтически неприемлемых солей, например пикратов или перхлоратов. Для терапевтического применения используются только фармацевтически приемлемые соли или свободные соединения (где приемлемо - в форме фармацевтических составов), и они являются, следовательно, предпочтительными.

Благодаря близости новых соединений в свободной форме и соединений в форме их солей, включая соли, которые могут использоваться в качестве промежуточных соединений, например, при очистке или идентификации новых соединений, любое указание на соединения в свободной форме здесь и далее должно пониматься как указание также соответствующих солей, где это подходит и является целесообразным.

Соединения формулы I и их N-оксиды имеют ценные фармакологические свойства, как описано здесь и далее.

Эффективность соединений по изобретению в качестве ингибиторов активности с-Abl, Bcr-Abl и VEGF-рецепторов тирозинкиназы может быть определена следующим образом.

Тест на активность по отношению к с-Abl протеинтирозинкиназе. Тест проводили как испытание на связывание следующим образом: His-меченый домен киназы с-Abl клонировали и экспрессировали в системе бакуловирус/Sf9, как описано у Bhat и др., J Biol Chem. 272, 16170-5 (1997). Белок 37 кДа (с-Abl киназа) очищали двухстадийным способом на колонке с хелатом кобальта и затем на анионообменной колонке с выходом 1-2 мг/л Sf9 клеток. Чистота с-Abl киназы составляла >90%, что определено SDS-PAGE после подкрашивания кумачовым синим. Испытание содержит: с-Abl киназу (50 нг), 20 мМ Tris-HCl, рН 7,5, 10 мМ MgCl₂, 10 мкМ Na₃VO₄, 1 мМ DTT и 0,06 мк Ci/испытание [γ³³ Р]-АТФ (5 мкМ АТФ) с 30 мкг/мл поли-Ala,Glu,Lys,Tyr - 6:2:5:1 (Poly-AEKY, Sigma P1152) в присутствии 1% ДМСО, общий объем 30 мкл. Реакции останавливали добавлением 10 мкл 250 мМ EDTA и 30 мкл реакционной смеси переносили на мембрану Immobilon-PVDF (Millipore, Bedford, MA, USA), предварительно пропитанную в течение 5 мин метанолом, промытую водой, затем пропитанную в течение 5 мин 0,5% H₃PO₄ и установленную на вакуумном коллекторе с неподсоединенным источником вакуума. После определения всех образцов подсоединяли вакуум и каждую ячейку промывали 200 мкл 0,5% H₃PO₄. Мембраны удаляли и промывали на мешалке 0,5% H₃PO₄ (4 раза) и один раз этанолом. Количественное определение мембран проводили после высушивания при температуре окружающей среды, устанавливая в Packard TopCount 96-ячеечную рамку и добавляя 10 мкл/ячейку Microscint TM (Packard).

Тест на активность в отношении Bcr-Abl. Мышечную миелоидную прародительскую клеточную линию 32Dcl3, трансфецированную с вектором экспрессии р210 Bcr-Abl pGDp210Bcr/Abl (32D-bcr/abl), получали от J. Griffin (Dana Faber Cancer Institue, Bosten, MA, USA). Клетки экспрессировали слитой белок Bcr-Abl с изначально активной abl киназой и пролиферировали независимо фактор роста. Клетки расширяли в RPMI 1640 (AMIMED), 10% эмбриональной телячьей сыворотке, 2 мМ глутамина (Gibco) («полная среда») и рабочий запас готовили замораживанием аликвотных количеств 2×10⁶ клеток на сосуд в замораживающейся среде (95% FCS, 5% ДМСО (SIGMA)). После оттаивания клетки использовали в течение максимально 10-12 раз в экспериментах.

Для клеточных испытаний соединения растворяли в ДМСО и разбавляли полной средой до получения исходной концентрации 10 мкМ с последующим получением 3-кратных серийных разбавлений в полной среде. 200'000 32D-Bcr/Abl клетки в 50 мкл полной среды высаживали в ячейки в 96-ячеечные круглодонные подложки для культуры ткани. К клеткам добавляли трижды 50 мкл на ячейку 3-кратных серийных разбавлений тестируемого соединения. Необработанные клетки использовались в качестве контроля. Соединение инкубировали вместе с клетками в течение 90 мин при 37°С, 5% СО₂, с последующим центрифугированием подложек культуры ткани при 1300 об/мин (центрифуга Beckmann GPR) и удалением супернатантов тщательным продуванием, чтобы не удалить разрушенные клетки. Остатки клеток подвергали лизису добавлением 150 мкл лизисного буфера (50 мМ Tris/HCl, pH 7,4, 150 мМ хлорида натрия, 5 мМ EDTA, 1 мМ EGTA, 1% NP-40, 2 мМ орто-ванадата натрия, 1 мМ PMSF, 50 мкг/мл апротинина и 80 мкг/мл леупептина) и немедленно использовали для ELISA или хранили замороженными в подложках при -20°С до применения. Черные подложки ELISA (черные подложки Packard HTRF-96) предварительно обрабатывали в течение ночи при 4°С 50 нг/ячейка поликлональным анти-abl-SH3 доменом Ab 06-466 кролика от Upstate в 50 мкл PBS. После промывки 3 раза 200 мкл/ячейка PBS, содержащим 0,05% Tween20 (PBST) и 0,5% TopBlock (Juro), оставшиеся сайты связывания белка блокировали 200 мкл/ячейка PBST, 3% TopBlock в течение 4 ч при комнатной температуре с последующим инкубированием с 50 мкл лизатов необработанных или обработанных соединением клеток (20 мкг общего белка на ячейку) в течение 3-4 ч при 4°С. После 3 промывок добавляли 50 мкл/ячейка анти-фосфотирозина Ab PY20(AP), меченного щелочной фосфатазой (Zymed), разбавленного до 0,2 мкг/мл в блокирующем буфере, и инкубировали в течение ночи (4°С). Для всех стадий инкубирования подложки закрывали крышками (Costar). Наконец, подложки промывали еще три раза промывочным буфером и один раз деионизированной водой перед добавлением 90 мкл/ячейка АР-субстрата CDPStar RTU с Emerald II. Подложки, закрытые Packard TopSeal™ - крышками для подложек, инкубировали в течение 45 мин при комнатной температуре в темноте и определяли количество люминесценции измерением показателей в секунду (CPS) с помощью Packard Top Count Microplate Scintillation Counter (Top Count). Подсчитывали различие между ELISA-считыванием (CPS), полученным для лизата с необработанными 32D-Bcr/Abl клетками, и считыванием для испытания-основы (все компоненты, но без клеточного лизата) и принимали за 100% отражения изначально фосфорилированного белка Bcr-Abl, присутствующего в этих клетках. Активность соединения относительно Bcr-Abl киназы выражали в виде процентного отношения уменьшения фосфорилирования Bcr-Abl. Значения IC₅₀ и IC₉₀ определяли из кривых зависимости от дозы графическим экстраполированием.

Тест на активность в отношении VEGF-рецептора тирозинкиназы. Тест проводили с помощью Flt-1 VEGF-рецептора тирозинкиназы. Подробная методика является следующей: 30 мкл раствора киназы (10 нг домена киназы Flt-1, Shibuya и др., Oncogene 5, 519-24 [1990]) в 20 мМ Tris*HCl pH 7,5, 3 мМ дихлорида марганца (MnCl₂), 3 мМ хлорида магния (MgCl₂), 10 мкМ ванадата натрия, 0,25 мг/мл полиэтиленгликоля (PEG) 20000, 1 мМ дитиотреитола и 3 мкг/мл поли(Glu,Tyr) 4:1 (Sigma, Buchs, Switzerland), 8 мкМ [³³Р]-АТФ (0,2 мкCi), 1% ДМСО и 0-100 мкМ тестируемого соединения инкубировали вместе в течение 10 минут при комнатной температуре. Реакцию затем останавливали добавлением 10 мкл 0,25 М этилендиаминтетраацетата (EDTA) pH 7. С помощью мультиканального распределительного устройства (LAB SYSTEMS, USA) аликвоту 20 мкл подавали на мембрану PVDF (= поливинилдифторид) Immobilon Р (Millipore, Bedford, USA), через микротитровальный складчатый фильтр Gibco-BRL и связанную с вакуумом. После полного разделения жидкости мембрану промывали 4 раза в бане, содержащей 0,5% фосфорную кислоту (H₃PO₄), и один раз этанолом, инкубировали в течение 10 минут каждый раз при встряхивании, затем устанавливали на Hewlett Packard TopCount Manifold и измеряли радиоактивность после добавления 10 мкл Microscint™ (жидкость для В-стинцилляционного счетчика). Определяли значения IC₅₀ линейным регрессионным анализом процентного отношения для ингибирования каждого соединения по крайней мере в четырех концентрациях (как правило, 0,01, 0,1, 1,0 и 10 мкмоль). Значения IC₅₀, которые могут быть обнаружены для соединений формулы I, находятся в пределах от 1 до 10'000 нМ, предпочтительно в области от 1 до 100 нМ.

Ингибирование вызванного VEGF автофосфорилирования KDR-рецептора может быть также подтверждено экспериментом in vitro на клетках: трансфицированные СНО клетки, которые постоянно экспрессируют рецептор VEGF человека (KDR), высаживали в полной культуральной среде с 10% эмбриональной телячьей сывороткой (FCS) в 6-ячеечные подложки для клеточной культуры и инкубировали при 37°С под 5% СО₂ до 80% слияния. Затем тестируемые соединения разбавляли культуральной средой (без FCS, с 0,1% бычьим сывороточным альбумином) и добавляли к клеткам. (Контроли содержали среду без тестируемых соединений.) Через два часа инкубирования при 37°С добавляли рекомбинатный VEGF; конечная концентрация VEGF составляла 20 нг/мл. После следующих пяти минут инкубирования при 37°С клетки промывали два раза ледяным PBS (фосфатно-буферный соляный раствор) и немедленно подвергали лизису в 100 мкл лизисном буфере на ячейку. Лизаты затем центрифугировали для удаления ядер клеток и определяли концентрации белка супернатантов с помощью коммерческого анализа белка (BIORAD). Затем лизаты могут немедленно использоваться или, при необходимости, храниться при -20°С.

Сэндвич ELISA проводили для измерения фосфорилирования рецептора KDR: моноклональное антитело для KDR (например, Mab 1495,12,14) иммобилизировали на черных подложках ELISA (OptiPlate™ HTRF-96 от Packard). Подложки затем промывали и оставшиеся свободные сайты связывания белка насыщали 1% БСА в PBS. Лизаты клеток (20 мкг белка на ячейку) затем инкубировали на этих подложках в течение ночи при 4°С вместе с антифосфотирозиновым антителом, связанным с щелочной фосфатазой (PY20:AP от Transduction Laboratories). Подложки промывали опять и затем определяли связывание антифосфотирозинового антитела с захваченным фосфорилированным рецептором с помощью люминисцентного АР субстрата (CDP-Star, готовый к использованию, с Emerald II; TROPIX). Люминисценцию измеряли с помощью Packard Top Count Microplate Scintillation Counter (Top Count). Различие между сигналом положительного контроля (стимулируемого VEGF) и сигналом отрицательного контроля (не стимулируемого VEGF) соответствует вызванному VEGF фосфорилированию рецептора KDR (=100%). Активность тестируемых веществ рассчитывали как % ингибирования вызванного VEGF фосфорилирования рецептора KDR, где концентрация вещества, которая проявляет половину от максимального ингибирования, определяли как ED₅₀ (эффективная доза для 50% ингибирования). Соединения формулы I предпочтительно проявляют значения ED₅₀ в области от 0,25 нМ до 1000 нМ, предпочтительно от 0,25 до 250 нМ.

Соединение формулы I или его N-оксид ингибирует также в различной степени другие тирозинкиназы, вовлеченные в передачу сигналов, которые медиируются трофными факторами, например Bcr-Abl и Abl киназой, Arg, киназами из семейства Src, особенно c-Src киназой, Lck и Fyn; также киназами семейства EGF, например с-erbB2 киназой (HER-2), с-erbB3 киназой, с-erbB4 киназой; киназой рецептора инсулиноподобного фактора роста (IGF-1 киназа), особенно членами семейства тирозинкиназ PDGF-рецептора, такими как киназа PDGF-рецептора, киназа CSF-1-рецептора, киназа Kit-рецептора и киназа VEGF-рецептора; а также серин/треониновыми киназами, каждая из которых играет роль в регулировании роста и трансформации клеток млекопитающего, включая клетки человека.

Ингибирование с-erbB2 тирозинкиназы (HER-2) может быть измерено, например, аналогично ингибированию EGF-R протеинкиназы, используя известные методики.

На основе этих исследований соединение формулы I в соответствии с изобретением проявляет терапевтическую эффективность особенно против заболеваний, зависимых от протеинкиназы, особенно пролиферативных заболеваний.

На основе их эффективности в качестве ингибиторов активности тирозинкиназы VEGF-рецептора соединения формулы I прежде всего ингибируют рост кровеносных сосудов и, таким образом, например, эффективны против множества заболеваний, связанных с нерегулируемым ангиогенезом, особенно заболеваний, вызванных глазной неоваскуляризацией, особенно ретинопатиями, такими как диабетическая ретинопатия или возрастные пятна, псориаз, гемангиобластома, такая как гаемангиома, пролиферативные заболевания мезангиальных клеток, такие как хронические или острые заболевания почек, например диабетическая нефропатия, злокачественный нефросклероз, синдром тромботической микроангиопатии или отторжение трансплантата, или особенно воспалительное заболевание почек, такое как гломерулонефрит, особенно мезангиопролиферативный гломерулонефрит, гемолитический-уремический синдром, диабетическая нефропатия, гипертензивный нефросклероз, атерома, артериальный рестеноз, аутоиммунные заболевания, диабет, эндометриоз, хроническая астма и особенно опухолевые заболевания (твердые опухоли, а также лейкемии и другие "жидкие опухоли", особенно опухоли, экспрессирующие c-kit, KDR, Flt-1 или Flt-3), такие как особенно рак груди, рак толстой кишки, рак легких (особенно рак маленьких клеток легких), рак простаты или саркома Капоши. Соединение формулы I (или его N-оксид) ингибирует рост опухолей и особенно подходит для предотвращения распространения метастатических опухолей и роста микрометастаз.

Соединение формулы I может вводиться отдельно или в комбинации с одним или несколькими другими терапевтическими агентами, возможная комбинированная терапия имеет форму фиксированных комбинаций или введение соединения по изобретению и одного или нескольких других терапевтических агентов, вводимых или принимаемых независимо друг от друга, или объединенное введение фиксированных комбинаций и одного или нескольких других терапевтических агентов. Соединение формулы I может, кроме того, вводиться особенно для лечения опухоли, такой как при лечении лейкемии, в комбинации с химиотерапией, радиотерапией, иммунотерапией, хирургическим вмешательством или их комбинацией. Одинаково возможна как длительная терапия, так и вспомогательная терапия с другими методами лечения, как описано выше. Другими возможными лечениями является терапия для поддержания состояния пациента после регресса опухоли или даже химиотерапии, например, у пациентов группы риска.

Терапевтическими агентами для возможной комбинации являются особенно один или несколько цитостатических или цитотоксических соединений, например химиотерапевтический агент или агенты, выбранные из группы, включающей индарубицин, цитарубицин, интерферон, гидроксимочевина, бисульфан или ингибитор биосинтеза полиамина, ингибитор протеинкиназы, особенно серин/треониновой протеинкиназы, такой как протеинкиназа С, или тирозиновой протеинкиназы, такой как тирозинкиназы рецептора эпидермального фактора роста, цитокин, отрицательный регулятор роста, такой как TGF-β или IFN-β, ингибитор ароматазы, классический цитостатический агент и ингибитор взаимодействия SH2 домена с фосфорилированным белком.

Соединение в соответствии с изобретением полезно не только для (профилактического и предпочтительно терапевтического) введения людям, но также и для лечения других теплокровных животных, например промышленно полезных животных, например грызунов, таких как мыши, кролики или крысы, или морских свинок. Такое соединение может также использоваться в качестве ссылочного стандарта в описанных выше тестовых системах для сравнения с другими соединениями.

Вообще изобретение также относится к применению соединения формулы I или его N-оксида для ингибирования активности тирозинкиназы, in vitro или in vivo.

В группах упомянутых далее предпочтительных соединений формулы I и их N-оксидов определения заместителей из общих упомянутых ранее определений могут успешно использоваться, например, для замены более общих определений более конкретными определениями или особенно предпочтительными определениями.

В частности, изобретение относится к соединениям формулы I, где

R₁ представляет собой водород, низший алкил, низший алкокси-низший алкил, ацилокси-низший алкил, карбокси-низший алкил, низший алкоксикарбонил-низший алкил или фенил-низший алкил;

R₂ представляет собой водород, низший алкил, необязательно замещенный одним или двумя одинаковыми или различными радикалами R₃, циклоалкил, бензциклоалкил, гетероциклил, арильную группу или моно- или бициклическую гетероарильную группу, включающую один, два или три атома азота или один атом серы, где арильная и гетероарильная группы в каждом случае являются незамещенными или моно- или полизамещенными;

и R₃ представляет собой гидрокси, низший алкокси, ацилокси, карбокси, низший алкоксикарбонил, карбамоил, N-моно- или N,N-дизамещенный карбамоил, амино, моно- или дизамещенный амино, циклоалкил, гетероциклил, арильную группу, фураноил, тиеноил или моно- или бициклическую гетероарильную группу, включающую один, два или три атома азота в кольце, ноль или один атом кислорода в кольце и ноль или один атом серы в кольце, где арильная и гетероарильная группы в каждом случае являются незамещенными или моно- или полизамещенными;

или где R₁ и R₂ вместе представляют собой алкилен с четырьмя или пятью атомами углерода, необязательно моно- или дизамещенный низшим алкилом, циклоалкилом, гетероциклилом, фенилом, гидрокси, низшим алкокси, амино, моно- или дизамещенным амино, пиридилом, пиразинилом или пиримидинилом; бензалкилен с четырьмя или пятью атомами углерода в алкиленовой группе; оксаалкилен с одним отомом кислорода и тремя или чет