Дрожжевой экстракт, содержащий гамма-glu-x или гамма-glu-x-gly, и способ его получения

Дрожжевой экстракт, содержащий гамма-glu-x или гамма-glu-x-gly, и способ его получения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники

Настоящее изобретение относится к дрожжевому экстракту, содержащему γ-Glu-X-Gly или γ-Glu-X, и к способу его получения. Дрожжевой экстракт согласно настоящему изобретению применим в области производства пищевых продуктов, таких как приправы и продукты для здоровья.

Предшествующий уровень техники

Дрожжевой экстракт придает пищевым продуктам «atsumi» (густоту), вкус «umami» и широко используется в качестве приправы в области пищевых продуктов. Известно, что особенно глутатион (далее также упоминается как «GSH»), представляющий собой трипептид, состоящий из глутаминовой кислоты, цистеина и глицина, придает пищевым продуктам вкус «kokumi» (Ueda et al., Agric. Biol. Chem., 54, 163-169 (1990), Ueda et al., Biosci. Biotechnolo. Biochem., 61, 1977-1980 (1997)), и разрабатываются различные приправы, содержащие GSH.

Между тем, хоть и сообщалось, что кальцийчувствительный рецептор (CaSR), являющийся G-белком класса С, реагирует на GSH (Wang et al., Journal of Biological Chemistry, 281, 8864-8870 (2006)), его физиологическая роль не ясна. Кроме того, этот CaSR присутствует также и в клетках языка, и считают, что это свидетельствует о его роли в ощущении вкуса (Gabriel et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, 378, 414-418 (2009)). Далее, недавно было показано, что CaSR участвует в различении людьми вкуса «kokumi» (Ohsu et al., Journal of Biological Chemistry, 285, 1016-1022 (2010)). В этой работе показано, что не только GSH, который уже известен как вещество со вкусом «kokumi», но, видимо, и несколько соединений γ-глутамила реагируют с CaSR. Кроме того, показано, что эти пептиды, имеющие общую формулу γ-Glu-X или γ-Glu-X-Gly (X представляет собой аминокислоту или производное аминокислоты, отличные от Cys и его производных), например, γ-Glu-Met, γ-Glu-Thr, γ-Glu-Val-Gly, и т.д. придают вкус «kokumi» (WO2007/055393). Кроме того, показано, что группа эфиров S- или O-карбоксиалкилированных пептидов γ-глутамила или β-аспарагила также являются соединениями со вкусом «kokumi» (WO2007/042288). Хотя эти пептиды придают пищевым продуктам вкус «kokumi» подобно GSH, в отличие от GSH, в их составе нет восстановленной SH-группы. Известно, что вещество, имеющее в своем составе восстановленную SH-группу, как, например, GSH, как правило, нестабильно и его титр снижается по мере образования дисульфидных связей (WO2007/042288). Однако γ-Glu-X, γ-Glu-X-Gly и т.д., которые считаются полезными как пептиды, придающие вкус «kokumi», не имеющие в своем составе восстановленной SH-группы, стабильны.

Что касается пищевых продуктов, содержащих γ-Glu дипептид, имеется сообщение о том, что различные γ-Glu дипептиды обнаружены в сыре Гауда, созревавшем в течение длительного периода, такого как 44 недели (Toelstede, S and Hofmann, Т, J. Agric. Food. Chem., 2009). В этой работе сообщается о том, что определены различные γ-Glu дипептиды, такие как γ-Glu-Ala, γ-Glu-Glu и γ-Glu-Gln, и определено содержание γ-Glu дипептидов - максимум 3590 мкмоль/кг. Это значение соответствует 0.088% сухого вещества.

Однако какой-либо дрожжевой экстракт, содержащий γ-Glu-X или γ-Glu-X-Gly в количестве, достаточном для придания вкуса «kokumi» не известен.

Кроме того, известно, что синтез и разложение глутатиона, одного из γ-глутамил-соединений, катализируется множеством ферментов, названных ферментами цикла γ-глутамила. В частности, известно, что γ-глутамилтранспептидаза переносит глутамат в γ-положении GSH к другому соединению, имеющему аминогруппу, с разложением GSH до цистеинилглицина (Protein Nucleic acid Enzyme, 1988-7, VOL. 33, NO. 9, ISSN 003909450, Special Issue «Epoch of glutathione research», pp.1432-1433). Считается, что если соединение, имеющее аминогруппу, в этой реакции перегруппировки - аминокислота, в качестве побочного продукта может образовываться дипептид γ-Glu-X. Однако поиски микроорганизмов, эффективно продуцирующих γ-Glu-X, не имели успеха, частично по причине того, что γ-Glu-X является побочным продуктом.

Сведения, касающиеся дипептида γ-Glu-X, включают анализ культуральной жидкости Micrococcus glutamicus (Ronald et al., Journal of Biological Chemistry, 240, p.2508-2511 (1965)). В этой работе приводятся сведения о том, что культуральную жидкость наносили на различные колонки для отделения пептидов и т.д., чтобы выделить γ-Glu-Glu, γ-Glu-Val и γ-Glu-Leu. Однако они были обнаружены в результате разделения на разных колонках, и неизвестно, в каком количестве они содержались в среде.

Кроме того, фермент, ответственный за биосинтез GSH, выделили из Streptococcus agalactiae и Clostridium acetobutylicum и проанализировали его субстратную специфичность (Kino et al., JBB research communications, 352, pp.351-359 (2007)). В биосинтезе GSH обычно принимают участие два вида ферментов, γ-глутамилцистеинсинтетаза, соединяющая Glu и Cys с образованием γ-Glu-Cys, и глутатионсинтетаза, соединяющая образовавшийся γ-Glu-Cys и Gly с образованием GSH. Однако в вышеупомянутых двух видах микроорганизмов имеется уникальный фермент, соответствующий гибриду γ-глутамилцистеинсинтетазы и глутатионсинтетазы. Имеются данные о том, что согласно результатам анализа in vitro, узнавание субстрата этим ферментом слабо выражено, например, он также узнает другие аминокислоты (не только Cys) и в результате может образовывать γ-Glu-X и γ-Glu-X-Gly. Однако это результаты теста in vitro, и не описаны примеры продукции этими микроорганизмами определяемых количеств пептидов, таких как γ-Glu-X и γ-Glu-X-Gly, внутри клеток, содержащих много соединений с аминогруппой помимо целевой X.

Дрожжевые экстракты являются приправами, широко использующимися в области пищевых продуктов, высоко ценящимися потребителями. Следовательно, в качестве носителя γ-Glu-X-Gly или γ-Glu-X, форма дрожжевого экстракта более предпочтительна. Примеры исследований по использованию таких экстрактов включают работы с минералосодержащими дрожжами. Известно, что если в среду добавить металл, дрожжи транспортируют его в клетку (В. Volesky, H.A., Appl. Microbiol. BiotechnoL, 42;797-806 (1995)). В частности, если следовые количества таких элементов как цинк, железо, медь, марганец, селен, молибден и хром, добавляются в среду, дрожжи могут использоваться в качестве источника элемента, обогащение которым пищевых продуктов желательно (Japanese Patent Laid-open (Kokai) No.2004-298014). С учетом этого факта развиваются способы получения минералосодержащих дрожжей (Japanese Patent Laid-open No.54-157890, Japanese Patent Laid-open No.60-75279, Japanese Patent Publication (Kokoku) No.6-16702).

Кроме того, обогащая дрожжи этими элементами, можно получать и преимущества, касающиеся вкусовых качеств. Например, в выложенной патентной заявке Японии No.8-332081 описаны дрожжи с высоким содержанием марганца. В ней описано, что хотя на рынке имеются пищевые продукты, обогащенные марганцем за счет добавления соли марганца, поскольку это неорганическая соль, следствием ее добавления является сильная горечь и вяжущие свойства, и регулярно потреблять их намного труднее, чем природные марганецсодержащие пищевые продукты, и раскрывается технология получения природного материала путем обогащения дрожжей марганцем. Что касается питательной ценности, технология раскрыта в выложенной патентной заявке Японии No.2008-99578. Согласно приведенным в заявке данным, хотя цинк вносит вклад в улучшение вкусовых ощущений, улучшение генеративной функции, и т.д., по-видимому, нельзя считать, что он сейчас потребляется в достаточном количестве. Если цинк добавляют в процессе культивирования дрожжей, дрожжи транспортируют цинк в клетки, но водорастворимый цинк не аккумулируется в дрожжах в чистом виде, а связывается с белком или аминокислотой и накапливается в высоких концентрациях в виде аморфного цинка. Видимо, такой аморфный цинк более эффективно абсорбируется в организме по сравнению с кристаллическим цинком. Как результат, включением цинка в дрожжи может быть получена улучшенная абсорбция по сравнению с потреблением цинка в чистом виде.

Как описано выше, различные преимущества могут быть получены за счет поглощения дрожжами целевого вещества и добавления дрожжей (в форме дрожжей или дрожжевого экстракта) в пищевые продукты. Однако в отличие от минералов, являющихся значимыми компонентами питания, способность дрожжей поглощать аминокислоту или пептид находится под сложным контролем, и считается, что трудно просто применить к ним вышеупомянутую технологию.

Среди исследований дипептидов и трипептидов дрожжей многие касаются образования GSH или γ-Glu-Cys. В качестве примера можно привести работу, в которой приводятся данные о том, что содержание GSH увеличили путем мутагенеза дрожжей Saccharomyces и отбора штамма, обладающего повышенной устойчивостью к цинку (выложенная патентная заявка Японии No.02-295480), сообщение о том, что супрессия экспрессии гена МЕТ25 была дерепрессирована благодаря мутантному гену МЕТ30, вследствие чего было увеличено внутриклеточное содержание γ-Glu-Cys (патентная заявка Японии No.2002-282743), и т.д. Кроме того, последние научные открытия включают данные о транспорте GSH через HGT1p. Хотя GSH и его димер, GSSG, транспортировались в клетки через HGT1p, на транспорт GSH транспортером HGT1p не влияло даже присутствие чрезмерного количества аминокислот, различных дипептидов и трипептидов. Следовательно, считается, что HGT1p является не неспецифическим транспортером, как полагали ранее, а транспортером, специфическим по отношению к GSH (Bourbouloux et al., Journal of Biological Chemistry, 275, pp.13259-13265 (2000)). Кроме того, также проведен поиск активных участков HGTIp (Kaur et al., FEMS Yeast Res., 9, 849-866 (2009)).

Как описано выше, хотя имеются сведения о многих открытиях, связанных с GSH и его предшественником, практически нет сведений о дрожжевых клетках, содержащих такие вещества, как γ-Glu-X и γ-Glu-X-Gly, и способе получения экстракта из этих клеток.

Краткое описание изобретения

Цели настоящего изобретения включают предоставление дрожжевого экстракта, содержащего γ-Glu-X или γ-Glu-X-Gly, и предоставление способа получения упомянутого экстракта.

Вышеупомянутый цели были достигнуты обнаружением того факта, что дрожжи транспортируют γ-Glu-X и γ-Glu-X-Gly (X представляет собой отличную от Cys аминокислоту или ее производное, то же относится к описанию, приведенному ниже) в клетку, и дрожжевой экстракт, содержащий γ-Glu-X или γ-Glu-X-Gly, может быть получен путем приготовления из указанных дрожжей, культивированных в среде, содержащей γ-Glu-X или γ-Glu-X-Gly. Кроме того, обнаружено, что если дрожжи культивируют в среде, содержащей γ-Glu-X или X-Gly, эти соединения транспортируются в клетки, и γ-Glu-X-Gly может образовываться в энзиматической реакции внутри клеток. Кроме того, также обнаружено, что дрожжевой экстракт, содержащий γ-Glu-X или γ-Glu-X-Gly, может быть получен при взаимодействии γ-глутамилтрансферазы с дрожжевым экстрактом, к которому добавлена аминокислота или пептид, выбранные из группы, состоящей из Х и X-Gly.

Целью настоящего изобретения является предоставление дрожжевого экстракта, содержащего пептид, выбранный из группы, состоящей из γ-Glu-X и γ-Glu-X-Gly, в количестве 0.005% или более от сухого веса дрожжевого экстракта, отличающегося тем, что Х представляет собой аминокислоту или ее производное, отличные от Cys и его производных.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше дрожжевого экстракта, содержащего пептид в количестве 0.02% или выше.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше дрожжевого экстракта, отличающегося тем, что Х - это Val.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше дрожжевого экстракта, отличающегося тем, что указанными дрожжами являются Saccharomyces cerevisiae.

Также целью настоящего изобретения является предоставление способа получения дрожжевого экстракта, содержащего пептид, выбранный из группы, состоящей из γ-Glu-X и γ-Glu-X-Gly, включающего выращивание дрожжей в питательной среде, содержащей пептид, выбранный из группы, состоящей из γ-Glu-X, γ-Glu-X-Gly и X-Gly, и приготовление из полученных клеток дрожжевого экстракта, отличающегося тем, что Х представляет собой аминокислоту или ее производное, отличные от Cys и его производных.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, отличающегося тем, что указанная питательная среда содержит 0.1 ppm (parts per million, 0,0001%) или более указанного пептида, и указанный дрожжевой экстракт содержит пептид, выбранный из группы, состоящей из γ-Glu-X и γ-Glu-X-Gly, в количестве 0.005% или более от сухого веса дрожжевого экстракта.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, отличающегося тем, что Х - это Val.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, отличающегося тем, что дрожжи модифицированы таким образом, что способность транспортировать указанный пептид в клетку в модифицированных дрожжах увеличена.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, отличающегося тем, что активность HGT1p в указанных дрожжах повышена.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, отличающегося тем, что указанными дрожжами являются Saccharomyces cerevisiae.

Также целью настоящего изобретения является предоставление способа получения дрожжевого экстракта, содержащего пептид, выбранный из группы, состоящей из γ-Glu-X и γ-Glu-X-Gly, включающего взаимодействие γ-глутамилтрансферазы с дрожжевым экстрактом, использующимся в качестве сырья, к которому добавлены аминокислота или пептид, выбранные из группы, состоящей из Х и X-Gly, отличающегося тем, что Х представляет собой аминокислоту или ее производное, отличные от Cys и его производных.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, отличающегося тем, что указанные аминокислота или пептид добавлены в количестве 1% или более от сухого веса дрожжевого экстракта, и указанный дрожжевой экстракт содержит пептид, выбранный из группы, состоящей из γ-Glu-X и γ-Glu-X-Gly, в количестве 0.005% или более от сухого веса дрожжевого экстракта.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, отличающегося тем, что Х - это Val.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, отличающегося тем, что указанными дрожжами являются Saccharomyces cerevisiae.

Согласно настоящему изобретению, можно получить дрожжевой экстракт, содержащий γ-Glu-X или/и γ-Glu-X-Gly. Дрожжевой экстракт, содержащий эти пептиды, обладает превосходным вкусом «kokumi».

Кроме того, дрожжевой экстракт, содержащий γ-Glu-X, также полезен в качестве сырья для получения дрожжевого экстракта, содержащего γ-Glu-X-Gly.

Краткое описание рисунков

На Фигуре 1 показаны масс-хроматограммы стандартных образцов γ-Glu-Val-Gly, γ-Glu-Val и Val-Gly.

На Фигуре 2 показана структура плазмиды pUC19AOX-G418-BRI.

На Фигуре 3 показана структура плазмиды pKS-URA3-13.

На Фигуре 4 показано конструирование плазмиды pKS-URA3-13-kanMX.

На Фигуре 5 показано конструирование плазмиды pLoxP-PADH1-kanR5.

На Фигуре 6 показано конструирование плазмиды pKS-URA3-PADH1-LR.

На Фигуре 7 показано конструирование плазмиды pKS-URA3-P-ADH1.

На Фигуре 8 показана схема получения фрагмента ДНК, использованного для замены промотора.

Подробное описание изобретения

Дрожжевой экстракт согласно настоящему изобретению содержит пептиды, выбранные из группы, состоящей из γ-Glu-X и γ-Glu-X-Gly, в количестве 0.005% или более от сухого веса дрожжевого экстракта, отличающиеся тем, что Х представляет собой аминокислоту или ее производное, отличные от Cys и его производных. Дрожжевой экстракт согласно настоящему изобретению содержит пептид предпочтительно в количестве не менее 0.005%, более предпочтительно - не менее 0.02%, еще более предпочтительно - не менее 0.1%, особенно предпочтительно - не менее 0.5% сухого веса дрожжевого экстракта.

Дрожжи, использующиеся в качестве сырья для получения дрожжевого экстракта согласно настоящему изобретению, - те же дрожжи, что и использующиеся в описанном ниже способе настоящего изобретения.

Glu и Gly пептида представляют собой глутаминовую кислоту и глицин соответственно. Символ «-» обозначает пептидную связь, «γ» в обозначении γ-Glu означает, что другая аминокислота связывается через карбокси-группу глутаминовой кислоты в γ-положении.

«X» представляет собой любую из 19 природных аминокислот или их производных, за исключением Cys и его производных. Cys представляет собой цистеин, и примеры его производных включают α-аминобутировую кислоту, β-аминобутировую кислоту, и т.д. Вышеупомянутые аминокислоты за исключением Cys и его производных включают нейтральные аминокислоты, такие как глицин (Gly), аланин (Аlа), валин (Val), лейцин (Leu), изолейцин (Ilе), серии (Ser), треонин (Thr), метионин (Met), аспарагин (Asn), глутамин (Gln) и пролин (Pro), кислые аминокислоты, такие как аспарагиновая кислота (Asp) и глутаминовая кислота (Glu), основные аминокислоты, такие как лизин (Lys), аргинин (Arg) и гистидин (His), и ароматические аминокислоты, такие как фенилаланин (Phe), тирозин (Туr) и триптофан (Тrр). В частности, когда Х-гидрофобная аминокислота, эффект вкуса «kokumi» пептида сильнее, и такой пептид предпочтительней. Примеры таких гидрофобных аминокислот включают Val, Ala, Leu, Phe, и т.д.

Примеры производных аминокислот включают, например, норвалин (nVal), норлейцин (nLeu), тертлейцин (tLeu), гидроксипролин (Hyp), и т.д.

Среди вышеупомянутых пептидов наиболее предпочтительны γ-Glu-Val-Gly, γ-Glu-Val и Val-Gly.

Кроме того, все вышеупомянутые аминокислоты и производные аминокислот являются L-изомерами.

Форма дрожжевого экстракта настоящего изобретения особым образом не ограничивается, и он может быть в виде порошка или раствора. Дрожжевой экстракт настоящего изобретения может использоваться так же, как и традиционные дрожжевые экстракты, например, в виде приправ, пищевых добавок, продуктов для здоровья, и т.д. Дрожжевой экстракт настоящего изобретения обладает превосходным свойством придания вкуса «kokumi». Поскольку свойство придания вкуса «kokumi» значительно усиливается при наличии вкуса «umami» или соленого вкуса, в дрожжевой экстракт могут быть добавлены вещества, придающие вкус «umami», такие как L-глутамат натрия и нуклеотиды, и/или соленые вещества, такие как хлорид натрия. Кроме того, вещества, придающие вкус «umami», могут добавляться к приправам, пищевым добавкам или продуктам для здоровья вместе с экстрактом настоящего изобретения.

Как показано в разделе «Примеры», дрожжевой экстракт, содержащий γ-Glu-Val-Gly, особенно раствор, содержащий дрожжевой экстракт, полученный описанным ниже способом согласно настоящему изобретению, имеет более выраженные свойства придания вкуса «kokumi» по сравнению с раствором γ-Glu-Val-Gly с такой же концентрацией γ-Glu-Val-Gly. Это доказывает эффективность дрожжевого экстракта настоящего изобретения.

Дрожжевой экстракт настоящего изобретения может быть получен, например, описанными ниже способами настоящего изобретения.

Первый способ согласно настоящему изобретению - способ получения дрожжевого экстракта, содержащего пептид, выбранный из группы, состоящей из γ-Glu-X-Gly и γ-Glu-X, включающий выращивание дрожжей в питательной среде, содержащей пептид, выбранный из группы, состоящей из γ-Glu-X-Gly, γ-Glu-X и X-Gly, и приготовление из полученных клеток дрожжевого экстракта, при этом Х представляет собой отличную от Cys и его производных аминокислоту или производное аминокислоты.

Для выбора дрожжей нет особенных ограничений при условии, что дрожжи могут транспортировать в клетку γ-Glu-X, γ-Glu-X-Gly или X-Gly. Примеры включают дрожжи, принадлежащие к роду Saccharomyces, такие как Saccharomyces cerevisiae, принадлежащие к роду Candida, такие как Candida utilis, принадлежащие к роду Pichia, такие как Pichia pastoris, и принадлежащие к роду Schizosaccharomyces, такие как Schizosaccharomyces pombe. Из них особенно предпочтительны Saccharomyces cerevisiae и Candida utilis, часто использующиеся для получения дрожжевого экстракта. Дрожжи настоящего изобретения могут быть гаплоидными или могут иметь диплоидность или более высокую полиплоидность.

Дрожжи могут быть любым штаммом дикого типа или мутантным штаммом при условии, что эти дрожжи могут транспортировать в клетки γ-Glu-X, γ-Glu-X-Gly или X-Gly и накапливать в клетках γ-Glu-X и/или γ-Glu-X-Gly. Примеры мутантных штаммов включают штамм, в котором усилены активности γ-глутамилцистеинсинтетазы (GSH1) и/или глутатионсинтетазы (GSH2). Дрожжи также могут быть модифицированы с целью улучшения транспорта γ-Glu-X, γ-Glu-X-Gly или X-Gly в клетки. Транспорт γ-Glu-X, γ-Glu-X-Gly или X-Gly может быть улучшен путем увеличения активности белка, принимающего участие в транспорте этих пептидов. Хотя считалось, что HGT1p является транспортером, специфичном по отношению к GSH, показано, что при увеличении активности HGT1p, транспорт γ-Glu-Val-Gly улучшается, как показано в разделе примеров. Следовательно, существует возможность, что при увеличении активности HGT1p улучшается транспорт в клетку не только γ-Glu-Val-Gly, но и γ-Glu-X, γ-Glu-X-Gly и/или X-Gly. Методы увеличения активности вышеупомянутого фермента или белка включают усиление его экспрессии путем замещения на хромосоме промотора гена, кодирующего фермент или белок, на более сильный промотор, усиление его экспрессии путем вставки целевого гена в хромосому для увеличения числа его копий до двух и более, усиление его экспрессии путем введения в дрожжи плазмиды, содержащей целевой ген, и т.п.

В качестве промотора высокоактивный тип традиционного промотора может быть получен с использованием репортерного гена или могут использоваться известные промоторы, обеспечивающие высокую экспрессию, такие как PGK1, PDC1, TDH3, TEF1 и НХТ7. С другой стороны, можно использовать плазмиду с ориджином репликации CEN4 или многокопийную плазмиду с ориджином репликации 2 мкм ДНК. Кроме того, можно использовать транспозон для введения целевого гена в любую область хромосомы или целевой ген может быть введен с использованием в качестве целевой последовательности кДНК, присутствующей в клетке в 150 копиях.

Усиление активности γ-глутамилцистеинсинтетазы раскрыто, например, в патенте США No.7,553,638; Otake Y. et al., Bioscience and Industry, volume 50, No.10, pp.989-994, 1992, и т.д. Хотя разрушение гена глутатионсинтетазы раскрыто в патенте США No.7,553,638, активность глутатионсинтетазы может быть усилена таким же образом, как и активность γ-глутамилцистеинсинтетазы. Активность HGT1p также может быть усилена подобным образом.

Нуклеотидные последовательности генов, кодирующих GSH1 и GSH2 Saccharomyces cerevisiae, раскрыты в базе данных Saccharomyces Genome Database (http://www.yeastgenome.org/). Нуклеотидные последовательности генов, кодирующих GSH1 и GSH2 Candida utilis, раскрыты в патенете США No.7,553,638. Нуклеотидная последовательнось гена, кодирующего GSH2 Saccharomyces cerevisiae, представлена в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO: 19. Аминокислотная последовательность, кодируемая этой нуклеотидной последовательностью, представлена в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:20.

Последовательность гена, кодирующего HGT1p, может быть получена из базы данных Saccharomyces Genome Database (http://www.yeastgenome.org/). Эта нуклеотидная последовательность также может быть получена как GSH11, ОРТ1 и т.п., синонимы HGT1p. Последовательность, раскрытая как GSH11 Saccharomyces cerevisiae, представлена в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO: 21. Кроме того, аминокислотная последовательность, кодируемая этой нуклеотидной последовательностью, представлена в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:22.

Способ получения дрожжевого экстракта разъясняется ниже.

Дрожжи выращивают в питательной среде, содержащей пептид. Состав питательной среды особым образом не ограничен, при условии, что выбирается среда, в которой дрожжи могут размножаться, и нет ограничений по SD среде, описанной в Примерах, и может использоваться среда, обычно используемая в производстве.

При выращивании дрожжей в вышеупомянутую питательную среду добавляют γ-Glu-X, γ-Glu-X-Gly или X-Gly. Можно добавлять один из видов этих пептидов или смесь из двух и более видов. Эти пептиды могут содержаться в питательной среде с начала культивирования или могут добавляться в питательную среду в любой момент в процессе культивирования. Когда указанные пептиды добавляют в питательную среду в процессе культивирования, предпочтительно добавлять их за 0-50 ч до окончания культивирования (0 часов означает, что культивирование прекращают сразу после добавления), более предпочтительно за 0.1-24 ч до окончания культивирования, особенно предпочтительно за 0.5-6 ч до окончания культивирования. Кроме того, при добавлении указанных пептидов в процессе культивирования они могут добавляться в непрерывном режиме.

Перед культивированием в питательной среде, содержащей указанные пептиды, может быть осуществлено предварительное культивирование. Питательная среда, использующаяся для предварительного культивирования, может содержать либо не содержать указанные пептиды.

Указанные пептиды обычно добавляют в питательную среду в количестве не менее 0.1 ppm, предпочтительно не менее 0.5 ppm, более предпочтительно не менее 1 ppm, еще более предпочтительно не менее 10 ppm, наиболее предпочтительно не менее 50 ppm, в выражении конечной концентрации в питательной среде в момент добавления. Хотя высшие пределы количества указанных пептидов особым образом не лимитируются, в качестве примера можно привести значение не более 100,000 или 50,000 ppm исходя из стоимости продукции, обычно не более 10,000 ppm, предпочтительно не более 1,000 ppm, более предпочтительно не более 500 ppm.

Условия культивирования могут быть такими же, что и обычно принятые при производстве дрожжевых экстрактов, они могут быть разными в зависимости от использующихся дрожжей. Можно использовать любые способы культивирования, такие как культивирование в периодической культуре, культивирование в периодической культуре с добавлением субстрата и непрерывное культивирование. Когда использующимися дрожжами являются Saccharomyces cerevisiae, предпочтительно аэробное культивирование со встряхиванием и т.п. при 25-35°С, более предпочтительно при 27-33°С, еще более предпочтительно при 28-32°С.

Если дрожжи культивируются, как описано выше, в клетках дрожжей накапливаются γ-Glu-X или/и γ-Glu-X-Gly. Когда γ-Glu-X или X-Gly добавляют в питательную среду, эти пептиды накапливаются в клетках, и, кроме того, также накапливается γ-Glu-X-Gly. Предполагается, что причина этого в том, что γ-Glu-X-Gly образуется из γ-Glu-X и X-Gly, транспортированных в клетку, при действии внутриклеточной γ-глутамилтрансферазы. Как показано в разделе Примеров, содержание γ-Glu-Val и γ-Glu-Val-Gly в дрожжах не коррелировало с содержанием в клетках GSH, и, следовательно, считается, что дрожжевые экстракты, полученные традиционными способами, не содержат γ-Glu-X или γ-Glu-X-Gly в высоких концентрациях, даже если их получают из дрожжей, содержащих GSH в высоких концентрациях.

Дрожжевой экстракт может быть приготовлен из полученных дрожжей таким же способом, что и использующийся при традиционном производстве дрожжевых экстрактов. Дрожжевой экстракт можно получать методом экстракции из клеток горячей водой и обработки экстракта, или методом разрушения клеток и обработки полученного в результате разрушения продукта. Кроме того, полученный дрожжевой экстракт можно при необходимости сконцентрировать или высушить с получением порошка.

Описанным выше способом получен дрожжевой экстракт, в котором увеличено содержание γ-Glu-X или/и γ-Glu-X-Gly. В наилучшем способе воплощения изобретения дрожжевой экстракт содержит γ-Glu-X или/и γ-Glu-X-Gly в суммарной концентрации не менее 0.005%, более предпочтительно не менее 0.02%, еще более предпочтительно не менее 0.1%, особенно предпочтительно не менее 0.5% сухого веса дрожжевого экстракта.

При воздействии γ-глутамилтрансферазы на содержащий γ-Glu-X дрожжевой экстракт, полученный, как описано выше, можно получить дрожжевой экстракт, содержащий γ-Glu-X-Gly.

Второй способ согласно настоящему изобретению - способ получения дрожжевого экстракта, содержащего пептид, выбранный из группы, состоящей из γ-Glu-X и γ-Glu-X-Gly, включающий воздействие γ-глутамилтрансферазы на дрожжевой экстракт, к которому добавлена аминокислота или пептид, выбранные из группы, состоящей из Х и X-Gly, где Х представляет собой аминокислоту или производное аминокислоты, отличные от Cys и его производных.

При воздействии γ-глутамилтрансферазы на Х или X-Gly образуется γ-Glu-X или γ-Glu-X-Gly. Следовательно, дрожжевой экстракт, содержащий γ-Glu-X или γ-Glu-X-Gly, может быть также получен при воздействии γ-глутамилтрансферазы на дрожжевой экстракт, содержащий Х или X-Gly. Дрожжевой экстракт, содержащий Х и/или X-Gly, может быть получен из дрожжей, выращенных в питательной среде, содержащей Х и/или X-Gly, или при добавлении Х и/или X-Gly к дрожжевому экстракту, использующемуся в качестве сырья.

Дрожжевой экстракт, использующийся в качестве сырья, может быть любым дрожжевым экстрактом, полученным традиционным способом.

К использующемуся в качестве сырья дрожжевому экстракту может быть добавлен один вид Х или X-Gly или смесь любых двух и более их видов. Х и/или X-Gly добавляют в суммарном количестве не менее 1%, предпочтительно не менее 5%, более предпочтительно не менее 10% сухого веса использующегося в качестве сырья дрожжевого экстракта.

Реакцию, катализируемую γ-глутамилтрансферазой, проводят в водном растворителе, таком как вода или буфер. Конкретно, например, использующийся в качестве сырья дрожжевой экстракт растворяют в водном растворителе и добавляют γ-глутамилтрансферазу. Условия реакции определяются в соответствии с использующейся γ-глутамилтрансферазой. Реакцию обычно проводят при рН 3-9 и температуре 15-70°С в течение 1-300 мин, предпочтительно при рН 5-8 и температуре 30-70°С в течение 5-150 мин.

Концентрация использующегося в качестве сырья дрожжевого экстракта может определяться удобством обращения. Указанная концентрация обычно составляет 0.1-50%, предпочтительно 0.5-20%, от сухого веса использующегося в качестве сырья дрожжевого экстракта.

Примеры γ-глутамилтрансферазы включают глутаминазу, γ-глутамилтранспептидазу (γ-GTP), и т.д. Что касается количества фермента, в случае γ-GTP, это обычно 0.001-1000 Ед/мл, предпочтительно 0.005-100 Ед/мл, более предпочтительно 0.01-25 Ед/мл, наиболее предпочтительно Ед/мл, где 1 Ед соответствует активности, при которой за 1 мин в растворе при рН 8.5 и температуре 25°С освобождается 1.0 мкМ р-нитроанилина из γ-глутамил-р-нитроанилида (определение дано в Sigma General Catalogue, 2008-2009 Edition, p.917). Количество глутаминазы также может быть определено тем же способом, что и для γ-GTP.

После ферментативной реакции может проводиться либо не проводиться обработка для инактивации γ-глутамилтрансферазы, например тепловая обработка при 80-100°С.

В качестве субстрата γ-глутамилтрансферазы в реакционную смесь можно добавить соединение γ-глутамил, например, GSH. GSH, содержащийся в дрожжевом экстракте, также может быть использован в качестве субстрата. В этом случае можно использовать дрожжевой экстракт, приготовленный из дрожжей, в которых увеличено содержание GSH, например, дрожжей, в которых усилены активности GSH1 или/и GSH2. Хотя более высокое содержание GSH в дрожжевом экстракте более предпочтительно, обычно это 1-50%, предпочтительно 1-30%, и более предпочтительно 5-20%, от сухого веса дрожжевого экстракта.

Таким описанным выше способом получают дрожжевой экстракт, в котором увеличено содержание γ-Glu-X или/и γ-Glu-X-Gly. В наилучшем способе осуществления изобретения дрожжевой экстракт содержит γ-Glu-X или/и γ-Glu-X-Gly в суммарном количестве не менее 0.005%, более предпочтительно не менее 0.02%, еще более предпочтительно не менее 0.1%, наиболее предпочтительно не менее 0.5% сухого веса дрожжевого экстракта.

Полученный дрожжевой экстракт при необходимости может быть сконцентрирован или высушен для получения порошка.

Примеры

Настоящее изобретение более подробно описано ниже со ссылкой на последующие Примеры, которые не ограничивают каким-либо образом рамки настоящего изобретения.

Пример 1: Определение γ-Glu-Val-Gly и γ-Glu-Val в различных дрожжевых экстрактах

Было измерено содержание γ-Glu-Val-Gly, γ-Glu-Val и Val-Gly в различных дрожжевых экстрактах. Измерение проводили путем получения флуоресцентных производных пептидов с использованием 6-аминохинолил-N-гидроксисукцинимидилкарбамата (AQC), и их определение с использованием LC-MS/MS в соответствии с описанным ниже способом. К 2.5 мкл каждого раствора различных дрожжевых экстрактов, разведенных до соотвествующей концентрации или к 2.5 мкл каждого стандартного раствора, содержащего γ-Glu-Val-Gly, γ-Glu-Val и Val-Gly соответственно, добавляли 2.5 мкл Milli-Q воды, 5 мкл 5 мкМ раствора внутреннего стандартного вещества (L-аланин-3,3,3-d3, Sigma (Ala-D3), DL-валин-2,3,4,4,4,5,5,5-d8, Sigma (Val-d8), оба меченые стабильным изотопом) и 30 мкл боратного буфера (прилагаемого к AccQ-Fluor (зарегистрированный товарный знак) Reagent Kit, Nihon Waters). К каждой смеси добавляли 10 мкл раствора реагента AQC (приготовленного путем растворения порошка вышеупомянутого реагента в 1 мл ацетонитрила). Полученную смесь нагревали при 55°С в течение 10 мин и затем к смеси добавляли 100 мкл 0.1% водного раствора муравьиной кислоты для приготовления образцов для анализа.

Затем приготовленный, как описано выше, образец сепарировали методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии, описанным ниже, и затем помещали в масс-спектрофотометр. Условия сепарации описаны ниже.

(1) ВЭЖХ: Agilent 1200 Series

(2) Разделительная колонка: Unison UK-Phenyl, внутренний диаметр: 2.0 мм, длина: 100 мм, размер частиц: 3 мкм (Imtakt)

(3) Температура колонки: 40°С

(4) Подвижная фаза А: водный раствор, полученный при доведении 25 мМ раствора муравьиной кислоты до рН 6.0 с использованием водного раствора аммиака

(5) Подвижная фаза В: метанол

(6) Скорость протока: 0.25 мл/мин

(7) Условия элюции: элюцию проводили с использованием смеси подвижной фазы А и подвижной фазы В. Отношение мобильной фазы В к смеси следующее: 0 мин (5%), 0-17 мин (5-40%), 17-17.1 мин (40-80%), 17.1-19 мин (80%), 19-19.1 мин (80-5%), 19.1-27 мин (5%).

Затем, производные соединения γ-Glu-Val-Gly, γ-Glu-Val и Val-Gly, элюированные при вышеупомянутых условиях разделения, помещали в масс-анализатор и определяли их количество методом масс-хроматографии. Условия определения были следующие.

(1) Масс-анализатор: АВ Sciex API3200 QTRAP

(2) Способ детекции: Контроль заданных ионов (режим определения положительных ионов)

(3) Заданный ион: Таблица 1

Таблица 1
Производное соединение	Первый масс-анализатор, (Q1)	Второй масс-анализатор, (Q3)
γ-Glu-Val-Gly	474.2	171.2
γ-Glu-Val	417.4	171.2
Val-Gly	345.4	171.2
Ala-d3	263.0	171.2
Val-d8	298.0	171.2

Количество производных соединений γ-Glu-Val-Gly, γ-Glu-Val и Val-Gly определяли с использованием программы Analyst ver. 1.4.2 (AB Sciex). В качестве внутреннего стандартного вещества для количественного определения использовали производное соединение Ala-d3 в случае γ-Glu-Val-Gly и γ-Glu-Val и производное соединение Val-d8 в случае Val-Gly, соответственно. Результаты представлены в Таблице 2. В этой таблице «ND» означает, что количество было меньше предела определения (то же будет применимо далее). Результаты анализа (масс-хромато граммы) производных внутренних стандартных аминокислот, γ-Glu-Val-Gly, γ-Glu-Val и Val-Gly стандартных образцов показаны на Фиг.1.

Таблица 2
	γ-Glu-Val-Gly	γ-Glu-Val	Val-Gly
Брэнд А	ND	0.3 ppm	0.5 ppm
Брэнд В	ND	ND	ND
Брэнд С	2.2 ppm	19.2 ppm	11.1 ppm
Брэнд D	ND	ND	0.4 ppm
Брэнд Е	3.1 ppm	25.9 ppm	33.1 ppm
Брэнд F	ND	ND	0.4 ppm
Брэнд G	4.6 ppm	38.3 ppm	0.4 ppm

Как видно из Таблицы 2, содержание γ-Glu-Val-Gly в различных дрожжевых экстрактах составляло максимум несколько ppm, содержание γ-Glu-Val и Val-Gly составляло максимум несколько десятков ppm, и таким образом исследованные экстракты практически не содержали γ-Glu-Val-Gly, γ-Glu-Val и Val-Gly.

Пример 2: Определение γ-Glu-Val-Gly и γ-Glu-Val в клетках различных дрожжей

Кроме того, определили внутриклеточное содержание γ-Glu-Val-Gly и γ-Glu-Val в различных дрожжах. Что касается штаммов, в качестве стандартного штамма использовали штамм Saccharomyces cerevisiae S288C, а в качестве штамма с высоким содержанием GSH использовали штамм Saccharomyces cerevisiae AJ14819 (депонированный при международном депонировании как штамм FERM ВР-08502). Штамм S288C хранится в независимом административном агентстве. National Institute of Technology and Evaluation, Biological Resource Center (NBRC, NITE Biological Resource Center, 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba-ken, 292-0818, Japan) под номером NBRC 1136, где его можно получить. Этот штамм также хранится в коллекции American Type Culture Collection (12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, United States of America) под номером АТСС 26108, где его можно получить. Штамм АJ14819 был получен в результате мутагенеза моноплоидного дрожжевого штамма, полученного из коммерчески доступного штамма Saccharomyces cerevisiae с EMS, и последующего отбора мутантного штамма, в котором экспрессия гена МЕТ25 не подавляется метионином, полученный штамм депонирован в независимом административном