Векторы и последовательности для лечения заболеваний

Векторы и последовательности для лечения заболеваний

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к векторам, пригодным для экспрессии целевых белков, и к их применению для генной терапии. Настоящее изобретение относится также к векторам и последовательностям нуклеиновых кислот, способствующих лечению мукополисахаридозов (MPS), и в частности, лечению мукополисахаридозов типа III или синдрома Санфилиппо.

Уровень техники

Лизосома представляет собой органеллу, находящуюся в цитоплазме эукариотных клеток, служащую в качестве структуры для хранения многих гидролитических ферментов и в качестве центра деградации и рециклизации компонентов клетки. Эта органелла содержит несколько типов гидролитических ферментов, включая протеазы, нуклеазы, гликозидазы, липазы, фосфолипазы и сульфатазы. Все ферменты представляют собой кислые гидролазы.

Заболевания, связанные с хранением в лизосомах (LSD), обусловлены генетическими дефектами, которые затрагивают один или более лизосомальных ферментов. Эти генетические заболевания возникают обычно в результате недостаточной активности конкретного фермента, присутствующего в лизосоме. В меньшей степени эти заболевания могут быть обусловлены нехваткой белков, вовлеченных в биогенез лизосом.

LSD являются редкими для индивидуумов заболеваниями, хотя в виде группы таких нарушений они относительно обычны в общей популяции. Суммарная распространенность LSD составляет приблизительно 1 на 5000 живых новорожденных. Смотрите Meikle P, et al, JAMA 1999; 281:249-254. Однако некоторые группы в пределах общей популяции особенно страдают от высокой встречаемости LSD. Например, коэффициенты распространенности болезней Гоше и Тея-Сакса у потомков, происходящих от евреев центральной и восточной Европы (ашкенази), составляет 1 на 600 и 1 на 3900 новорожденных, соответственно. Финская популяция также характеризуется необычно высоким коэффициентом распространенности LSD.

Мукополисахаридозы типа III (MPSIII), известные в целом как синдром Санфилиппо, представляют собой LSD, причиной которых является дефицит одного из ферментов, участвующих в разрушении гепаран-сульфата, ведущий к его патологической аккумуляции. MPSIII делятся на четыре подтипа в зависимости от недостаточности определенного фермента. Потеря сульфамидазной активности вызывает подтип IIIA и, как сообщается, он является наиболее тяжелым с наиболее ранним возникновением заболевания и самой короткой выживаемостью. Симптомы MPSIIIA возникают в первые годы жизни и характеризуются тяжелой нейродегенерацией, которая ведет к глубокой задержке умственного развития, агрессивности, гиперактивности и нарушениям сна. Больные постепенно теряют способность говорить, глотать и основную координацию движений. Кроме неврологических симптомов больные MPSIIIA страдают от неневрологических изменений, включая гепато- и спленомегалию, пороки развития скелета и суставов, а также от частой диареи и инфекций дыхательных путей. Прогрессирующее ухудшение симптомов ведет к смерти больного в подростковом возрасте. Смотрите Neufeld E, Muenzer J, «The mucopolysaccharidoses» in Scriver C, et al., Eds., «The metabolic and molecular basis of inherited disease» (McGraw-Hill Publishing Co., New York, NY, US, 2001, pp. 3421-3452).

В настоящее время не существует метода лечения MPSIIIA и, следовательно, существующие типы лечения направлены на контролирование симптомов заболевания, для того, чтобы повысить низкое качество жизни больных. Нарушения MPS может лечить с помощью трансплантации костного мозга или путем заместительной терапии ферментом (ERT). Оба подхода основываются на эндоцитозе лизосомальных ферментов из внеклеточной среды и их направленной доставке к лизосомам через рецептор манноза-6-фосфата (M6PR), присутствующий на клеточной мембране. Тем не менее, трансплантация костного мозга, как показано, является неэффективной для лечения больных MPSIII. Смотрите Sivakamur P, Wraith J, J. Inherit. Metab. Dis. 1999; 22:849-850. ERT, как всесторонне доказано, является эффективной в противодействии неневрологической аккумуляции при других заболеваниях, касающихся хранения в лизосомах, включая MPSI, II и VI. Смотрите Harmatz P, et al., J. Mol. Genet. Metab. 2008; 94:469-475; Muenzer J, et al., Genet. Med. 2006; 8:465-473 и Wraith J, et al., J. Pediatr. 2004; 144:581-588. Кроме высокой стоимости этих типов лечения, показано, что ERT не приводит к коррекции или сохранению функции нейронов из-за неудовлетворительного прохождения предоставляемого экзогенно фермента через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ). Смотрите Enns G, Huhn S, Neurosurg. Focus 2008; 24:E12. Позднее было показано, что ERT в высоких дозах приводит к частичному успеху в очистке компартментов хранения в ЦНС при MPS VII, возможно из-за насыщения M6PR и рецепторов маннозы, что ведет к более длительному периоду полужизни белка в циркуляторном русле. Смотрите Vogler C, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2005; 102:14777-14782. В этом исследовании продемонстрировано, что высокие уровни фермента в циркуляторном русле в течение длительных периодов времени коррелируют с лучшей коррекцией патологии. Доставка фермента внутрь мозга или в СМЖ, как было доказано, также является эффективной в отношении снижения патологических изменений ЦНС у мышей с MPS IIIA. Смотрите Hemsley K, et al., Genes Brain Behav. 2008; 53(2):161-8 и Savas P, et al., Mol. Genet. Metab. 2004; 82:273-285. Однако этот подход является высоко инвазивным из-за необходимости множественных повторяющихся инъекций и может повышать риск повреждения и/или инфицирований мозга.

Из-за ограничений имеющихся в настоящее время терапевтических возможностей для лечения MPSIII необходимы альтернативные подходы. С помощью переноса генов можно обеспечить способами достижения постоянной продукции утерянного фермента при одноразовом вмешательстве. Аденоассоциированные векторы (AAV) быстро распространяются в качестве вектора выбора для многих вариантов применения генной терапии из-за высокой эффективности их трансдукции и отсутствия их патогенности. Векторы AAV эффективно трансдуцируют постмитотические клетки, и некоторые доклинические и клинические исследования продемонстрировали возможности переноса генов, опосредованные векторами AAV, для эффективно передаваемой продолжительной экспрессии терапевтических трансгенов при разнообразных заболеваниях. Смотрите Daya S, Berns K, Clin. Microbiol. Rev. 2008; 21:583-593.

Было показано, что введение вектора AAV5, коэкспрессирующего сульфамидазу и активатор сульфатазы SUMF1, в боковые желудочки новорожденных мышей MPSIIIA способно корректировать многие неврологические и поведенческие изменения. Смотрите Fraldi A, et al., Hum. Mol. Genet. 2007; 16:2693-2702. Однако этот предлагаемый образ действия имеет несколько недостатков. Во-первых, используемый промотор CMV, как сообщалось, подавляется. Во-вторых, длительные эффекты коэкспрессии сульфамидазы и SUMF1 не оцениваются вообще. Неясно даже, является ли коэкспрессия SUMF необходимой и предоставляет ли какие-либо дополнительные постоянные преимущества по сравнению с лечением только сульфамидазой. В-третьих, векторы AAV5 характеризуются слабым распределением в пределах паренхимы, и, более важно, что доставка сульфамидазы в мозг с использованием этих векторов не приводит к какой-либо трансдукции ткани мозга, таким образом, при использовании этого подхода не достигается никакой коррекции соматического фенотипа. Наконец Fraldi, 2007, выше, продемонстрировал эффективность переноса генов только у новорожденных мышей MPSIIIA. Не сообщалось ни о каких экспериментах с мышами более старшего возраста. Так как MPSIIIA обычно диагностируется после 3-4-летнего возраста, модель новорожденных животных не является адекватной для прогнозирования эффектов этого лечения у человека.

Принимая во внимание трудности диагностирования MPSIIIA при рождении, предлагается развитие терапевтических вмешательств, начинающихся рано во взрослом состоянии. Сообщалось, что внутривенная доставка лентивирусного вектора, экспрессирующего сульфамидазу, взрослым мышам приводила к небольшому улучшению фенотипа ЦНС вероятно из-за относительно плохого осуществления трансдукции этих векторов in vivo. Смотрите McIntyre C, et al., Mol. Genet. Metab. 2008; 93:411-418. Таким образом, использование вирусных векторов с более высокой эффективностью трансдукции in vivo, таких как векторы AAV, может обеспечить более высокими уровнями сульфамидазы в циркуляторном русле, что потенциально может улучшить или скорректировать неврологическую патологию.

Лечение MPSIIIA с помощью генной терапии требует более эффективных векторов и кодирующих сульфамидазу последовательностей. Следовательно, существует назревшая необходимость эффективного лечения MPSIIIA. Существует также потребность в новых подходах к лечению этого заболевания, которые должны иметь повышенные признаки надежности. MPSIIIA является редким заболеванием и является, следовательно, орфанным заболеванием. Фармакологические агенты, разрабатываемые специально для лечения этого редкого клинического состояния, должны быть орфанными лекарствами.

Краткое изложение сущности изобретения

Настоящее изобретение относится к новой нуклеотидной последовательности для лечения заболеваний, предпочтительно для лечения мукополисахаридозов (MPS). Следовательно, в первом аспекте изобретение относится к нуклеотидной последовательности, которая представляет собой последовательность сульфамидазы человека с оптимизированными кодонами, позволяющую транскрибировать более стабильную мРНК. Эта последовательность транскрибируется с более высокими скоростями и, следовательно, фермент сульфамидаза продуцируется с более высокими выходами. Последовательность характеризуется лучшим профилем экспрессии и является терапевтически более эффективной при сравнении с другими попытками оптимизации кодонов нуклеотидной последовательности сульфамидазы. Следствием этих повышенных уровней экспрессии фермента является повышение сульфамидазной активности в сыворотке, позволяющее снизить аккумуляцию гликозаминогликанов (GAG), которая вызывает заболевание. Указанная последовательность представляет собой SEQ ID NO:1 или последовательность, идентичную последовательности SEQ ID NO:1 по меньшей мере на 85%, которая кодирует белок SEQ ID NO:2.

Во втором аспекте изобретение относится к генетической конструкции, включающей нуклеотидную последовательность согласно первому аспекту изобретения.

Настоящее изобретение также относится к новым векторам AAV серотипа 9, которые способны проходить через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) и проявляют более высокий тропизм в отношении различных структур мозга. Это позволяет сульфамидазной активности специфически повышаться в мозге, снижая аккумуляцию GAG, и следовательно, улучшать неврологические симптомы MPS. AAV серотипа 9 проявляет также неожиданно высокий тропизм в отношении сердца, поджелудочной железы и мышечной ткани, таким образом усиливая суммарные терапевтические преимущества изобретения.

Например, после введения векторов AAV серотипов 8 и 9 (AAV8 и AAV9) взрослым мышам MPSIIIA с помощью внутривенной (в/в) инъекции для направленной доставки в печень или с помощью внутримышечной (в/м) инъекции для направленной доставки в скелетную мышцу, или внутрицистернально (i.c.) для направленной доставки в центральную нервную систему, уровни экспрессии сульфамидазы, достигаемые при внутримышечной доставке вектора не являлись терапевтическими. Внутрицистернальное введение было способно не только повышать уровень сульфамидазы в циркуляторном русле, но также возвращать к исходному состоянию соматический фенотип MPSIIIA в нескольких типах ткани, включая ткань мозга. Подход, направленный на доставку в печень, также обладал способностью создавать высокие уровни сульфамидазной активности в циркуляторном русле, что неожиданно полностью исправляло соматический фенотип MPSIIIA в отношении компартмента хранения и существенно исправляло нейропатологию, связанную с заболеванием. Эти результаты являются доказательством эффективности переноса гена сульфамидазы, опосредованного AAV, у взрослых мышей MPSIIIA, модели заболевания, весьма сходной с клиническими проявлениями у человека. Изобретатели были в состоянии полностью скорректировать как соматические, так и неврологические изменения при MPSIIIA.

Генетические конструкции по настоящему изобретению могут дополнительно включать подходящие промоторы, такие как промоторы CAG или hAAT, для контроля и усиления экспрессии сульфамидазы. Например, промотор CAG является более стабильным, чем промотор CMV, и, следовательно, более приспособлен для индукции экспрессии сульфамидазы в течение более длительных периодов времени. С другой стороны, безопасность и эффективность промотора hAAT делает его идеальным носителем для последующей доставки или поддержания доз сульфамидазы. Контролирование экспрессии SEQ ID NO:1 промоторами CAG или hAAT значительно усиливало ее терапевтические эффекты.

Векторы AAV по настоящему изобретению также повышают сульфамидазную активность, что снижает аккумуляцию GAG и улучшает клинический исход у индивидуумов, страдающих MPS. Может быть достаточным только одно введение, потому что промотор и нуклеотидная последовательность сульфамидазы, локализованные между концевыми обратными повторами (ITR), включаются в геном клеток индивидуума. Следовательно, единственное парентеральное введение достаточно для получения долгосрочного эффекта.

В третьем аспекте изобретение относится к фармацевтической композиции, включающей нуклеотидную последовательность по первому аспекту изобретения, генетическая конструкция или экспрессионный вектор по изобретению.

В четвертом аспекте изобретение относится к нуклеотидной последовательности, генетической конструкции, экспрессионному вектору или фармацевтической композиции по изобретению для применения в качестве лекарственного средства. Лекарственное средство может быть использовано для повышения сульфамидазной активности в организме, для замещающей терапии ферментом, для генной терапии или для лечения MPS.

В пятом аспекте изобретение относится к способу получения экспрессионных векторов по первому и второму аспектам изобретения.

В шестом аспекте изобретение относится к способу получения фармацевтических композиций по третьему аспекту изобретения.

В седьмом аспекте изобретение относится к способу лечения индивидуума, страдающего мукополисахаридозом типа IIIA, по первому, второму и третьему аспектам изобретения.

Настоящее изобретение также относится к применению нуклеотидной последовательности, генетической конструкции, экспрессионного вектора или фармацевтических композиций по изобретению для получения лекарства с целью повышения сульфамидазной активности в организме, для замещающей терапии ферментом, для генной терапии или для лечения мукополисахаридозов или мукополисахаридоза типа IIIA.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1. Внутримышечная доставка AAV1-CAG-mu-SFMD-WPRE. (A) Сульфамидазная активность в скелетной мышце у мышей в контроле, при MPS и в результате лечения. (B) Сульфамидазная активность в сыворотке у мышей в контроле, при MPS и в результате лечения. (C) Количественное определение гликозаминогликана (GAG) в печени у мышей в контроле, при MPS и в результате лечения. Величины представляют собой среднее ± ст. ош. средн. у от 4 до 8 мышей на группу. ¥ P<0,05 относительно контроля, # P<0,05 относительно самцов, * P<0,05 относительно MPS без лечения. Н.О.: не определяли.

Фиг. 2. Внутримышечная доставка AAV8-CAG-mu-SFMD-WPRE. (A) Сульфамидазная активность в скелетной мышце у мышей в контроле, при MPS и в результате лечения. (B) Сульфамидазная активность в сыворотке у мышей в контроле, при MPS и в результате лечения. (C) Количественное определение гликозаминогликана (GAG) в печени у мышей в контроле, при MPS и в результате лечения. Величины представляют собой среднее ± ст. ош. средн. у от 4 до 8 мышей на группу. ¥ P<0,05 относительно контроля, # P<0,05 относительно самцов, * P<0,05 относительно MPS без лечения. Н.О.: не определяли.

Фиг. 3. Внутривенная доставка AAV8-CAG-mu-SFMD-WPRE. (A) Сульфамидазная активность в печени у мышей в контроле, при MPS и в результате лечения. (B) Сульфамидазная активность в сыворотке у мышей в контроле, при MPS и в результате лечения. (C) Количественное определение гликозаминогликана (GAG) в печени у мышей в контроле, при MPS и в результате лечения. Величины представляют собой среднее ± ст. ош. средн. у от 4 до 8 мышей на группу. ¥ P<0,05 относительно контроля, # P<0,05 относительно самцов, * P<0,05 относительно MPS без лечения. Н.О.: не определяли.

Фиг. 4. Внутривенная доставка AAV8-hAAT-mu-SFMD. (A) Сульфамидазная активность в печени у мышей в контроле, при MPS и в результате лечения. (B) Сульфамидазная активность в сыворотке у мышей в контроле, при MPS и в результате лечения. (C) Количественное определение гликозаминогликана (GAG) в печени у мышей в контроле, при MPS и в результате лечения. Величины представляют собой среднее ± ст. ош. средн. у от 4 до 8 мышей на группу. ¥ P<0,05 относительно контроля, # P<0,05 относительно самцов, * P<0,05 относительно MPS без лечения. Н.О.: не определяли.

Фиг. 5. Улучшение неврологической патологии у мышей MPSIIIA в результате внутривенной доставки AAV8-hAAT-mu-SFMD. (A) Сульфамидазная активность в различных отделах мозга (изображены на диаграмме) у самцов в контроле, при MPS и в результате лечения. (B) Количественное определение гликозаминогликана (GAG) в тех же отделах мозга. Величины представляют собой среднее ± ст. ош. средн., у от 4 до 8 мышей на группу. ¥ P<0,05 относительно контроля, * P<0,05 относительно MPS без лечения. ND: не определяли. (C) Трансмиссионная электронная микроскопия клеток Пуркинье в мозжечке. Тела нейронов Пуркинье мышей с MPSIIIA без лечения были заполнены множественными электронно-плотными включениями (белые стрелки), тогда как у самцов, которых лечили в/в-AAV8-hAAT, было найдено меньше включений более мелкого размера (черные стрелки).

Фиг. 6. Внутривенная доставка AAV9-CAG-mu-SFMD. (A) Сульфамидазная активность в различных отделах мозга (изображены на диаграмме) у мышей в контроле, при MPS и в результате лечения. (B) Количественное определение гликозаминогликана (GAG) в тех же отделах мозга. (C) Оценка моторной функции с помощью теста с вращающимся с ускорением стержня. Величины представляют собой среднее ± ст. ош. средн. у от 4 до 8 мышей на группу. ¥ P<0,05 относительно контроля, * P<0,05 относительно MPS без лечения.

Фиг. 7. Трансдукция в мозг после внутрицистернальной доставки аденоассоциированных вирусных векторов GFP серотипов 1, 2, 5, 7, 8 и 9. Дозу 5×10¹⁰ векторных геномов соответствующего вектора вводили внутрицистернально животным 2-месячного возраста, которых через 2 недели забивали и подвергали анализу. Аденоассоциированный вирус серотипа 9 продемонстрировал самую высокую эффективность трансдукции во всех анализируемых областях. Шприц указывает путь доставки вектора, cisterna magna. P: варолиев мост, Cb: мозжечок, OB: обонятельная луковица, Ht: гипоталамус, Cx: кора мозга.

Фиг. 8. Внутрицистернальная (ic) доставка векторов AAV9-CAG-mu-SFMD. Количественное определение гликозаминогликана (GAG) в различных отделах мозга (изображены на диаграмме) у мышей в контроле, при MPS и в результате лечения. Величины представляют собой среднее ± ст. ош. средн. у 3 мышей на группу. ¥ P<0,05 относительно контроля, * P<0,05 относительно MPS без лечения.

Фиг. 9. Внутривенная доставка AAV9-CAG-hu-co-SFMD. Сульфамидазная активность в печени у контрольных мышей, мышей с MPS и мышей, которых лечили либо AAV9-CAG-mu-SFMD (неоптимизированным геном), либо AAV9-CAG-hu-co-SFMD (оптимизированным геном).

Фиг. 10. Снижение патологии лизосом у окружающих нейроны глиальных клеток затылочной коры. Трансмиссионная электронная микроскопия, изображающая кортикальные нейроны затылочной коры и ассоциированные с ними глиальные клетки. Лизосомная патология была намного сильнее выражена в окружающих нейроны глиальных клетках по сравнению с нейронами. Показано присутствие больших электронно-прозрачных вакуолей в образцах глиальных клеток от мышей MPSIIIA, не подвергавшихся лечению (белые стрелки, правая верхняя панель), и их отсутствие в образцах дикого типа (левая верхняя панель). Это увеличение лизосомного компартмента было существенно снижено у мышей, которых лечили в/в-AAV8hAAT, и большинство окружающих нейроны глиальных клеток в этих образцах имели вид, сходный с видом у дикого типа (нижние панели). (1) нейрон, (2) окружающая нейрон глиальная клетка.

Фиг. 11. Выживаемость у самцов и самок, которых лечили внутривенной доставкой AAV8-hAAT-SFMD. (A) Анализ с помощью кривых выживаемости Каплана-Мейера для самцов дикого типа, самцов с MPSIIIA и самцов, которых лечили с помощью внутривенной доставки AAV8-hAAT-SFMD. Лечение с помощью направленной на печень генной терапии, опосредуемой AAV, значительно увеличивало продолжительность жизни животных с MPSIIIA (p<0,001). (B) Анализ с помощью кривых выживаемости Каплана-Мейера для самок дикого типа, самок с MPSIIIA и самок, которых лечили в/в-AAV8-hAAT-SFMD. Лечение с помощью направленной на печень генной терапии, опосредуемой AAV, не увеличивало продолжительность жизни животных с MPSIIIA (p=0,467).

Фиг. 12. Выживаемость у самцов и самок, которых лечили внутрицистернальной (ic) и внутривенной доставкой AAV9-CAG-mu-SFMD. (A) Анализ с помощью кривых выживаемости Каплана-Мейера самцов (A) и самок (B) дикого типа, с MPSIIIA и получавших лечение AAV9. Как внутрицистернальное, так и внутривенное лечение с помощью опосредуемой AAV генной терапии увеличивало продолжительность жизни животных с MPSIIIA.

Фиг. 13. Внутрицистернальное введение векторов AAV9 собакам приводит к трансдукции широко распространенных областей ЦНС и печени. Иммуногистохимическое определение GFP на срезах ЦНС и печени собаки, которой вводили AAV9-GFP через cisterna magna. Изображения соответствуют: (a) спинному мозгу, (b) оливе продолговатого мозга, (c) ядрам шва варолиева моста, (d) гипоталамическим ядрам, (e) обонятельному мозгу, (f) затылочной коре, (i) мозжечку, (j) зубчатой извилине гиппокампа. Отрезок масштаба: 1 мм для (a), 500 мкм для (b)-(h), 100 мкм для (i)-(j).

Фиг. 14. Трансдукция в печень после внутрицистернальной доставки вектора AAV9-GFP здоровым собакам породы Бигль. Иммуногистохимическое определение GFP на срезах печени, подкрашенных гематоксилином. Показаны репрезентативные изображения у собаки 1 (A) и собаки 2 (B). Исходное увеличение 200Х.

Фиг. 15. Сульфамидазная активность сыворотки и содержание GAG в печени у животных с внутривенным введением AAV9-co-hu-SFMD. (A) Сульфамидазная активность в сыворотке, измеренная с флуорогенным субстратом. (B) Запасание GAG в печени через 2 месяца после введения вектора.

Депонирование микроорганизмов

Плазмида pAAV-CAG-co-hu-SFMD была депонирована 16 мая 2011 года под номером доступа DSM 24817 в DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Inhoffenstβe 7 B, D-38124 Braunschweig, Федеративная республика Германия.

Плазмида pAAV-CAG-mu-SFMD была депонирована 16 мая 2011 года под номером доступа DSM 24818 в DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Inhoffenstβe 7 B, D-38124 Braunschweig, Федеративная республика Германия.

Плазмида pGG2-hAAT-mu-SFMD была депонирована 16 мая 2011 года под номером доступа DSM 24819 в DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Inhoffenstβe 7 B, D-38124 Braunschweig, Федеративная республика Германия.

Определения

Термин «нуклеотидная последовательность» относится к молекуле нуклеиновой кислоты, либо ДНК, либо РНК, содержащей дезоксирибонуклеотиды или рибонуклеотиды. Нуклеиновая кислота может быть двухцепочечной, одноцепочечной или содержать части как двухцепочечной, так и одноцепочечной последовательности.

Термин «% идентичности последовательностей» относится к процентному содержанию нуклеотидов кандидатной последовательности, которые идентичны нуклеотидам в SEQ ID NO:1 после выравнивания последовательностей с достижением максимального % идентичности последовательностей. % идентичности последовательностей может быть определен с помощью любых методов или алгоритмов, установленных в данной области техники, таких как алгоритмы ALIGN, BLAST и BLAST 2.0. Смотрите Altschul S, et al., Nuc. Acids Res. 1977; 25:3389-3402 и Altschul S, et al., J. Mol. Biol. 1990; 215:403-410.

В настоящем описании % идентичности последовательностей рассчитывается путем деления количества нуклеотидов, которые после выравнивания идентичны SEQ ID NO:1 и кандидатной последовательности, на общее количество нуклеотидов в SEQ ID NO:1 и умножения результата на 100.

Термин «кодировать» относится к генетическому коду, который определяет как транслируется нуклеотидная последовательность в полипептид или белок. Порядок нуклеотидов в последовательности определяет порядок аминокислот в полипептиде или белке.

Термин «белок» относится к линейной цепи аминокислот или полипептиду, которые укладываются в глобулярную структуру. Белки могут претерпевать посттрансляционные модификации, такие как превращение цистеинового остатка в 3-оксоаланин, гликозилирование или связывание металла. Гликозилирование белка представляет собой добавление различных углеводов, которые ковалентно связываются с аминокислотной цепью.

Термин «эффективное количество» относится к количеству вещества, достаточному для достижения предназначенной цели. Например, эффективное количество экспрессионного вектора для повышения сульфамидазной активности представляет собой количество, достаточное для снижения аккумуляции гликозаминогликана. «Терапевтически эффективное количество» экспрессионного вектора для лечения заболевания или нарушения представляет собой количество экспрессионного вектора, достаточное для снижения или устранения симптомов заболевания или нарушения. Эффективное количество данного вещества должно варьироваться в связи с такими факторами, как природа вещества, путь введения, размер и вид животного, получающего вещество, и цель назначения вещества. Эффективное количество в каждом индивидуальном случае может быть определено эмпирически специалистом в данной области техники в соответствии с методами, принятыми в данной области техники.

Термин «индивидуум» относится к произвольному животному, предпочтительно к человеку или млекопитающему, не являющемуся человеком, более предпочтительно к мыши, крысе, другим грызунам, кролику, собаке, кошке, свинье, корове, лошади или примату, еще более предпочтительно к человеку.

Термин «функционально связанный» относится к функциональному отношению и локализации промоторной последовательности по отношению к целевому гену (например, промотор или энхансер является функционально связанным с кодирующей последовательностью, если он воздействует на транскрипцию последовательности). Обычно функционально связанный промотор примыкает к интересующей последовательности. Однако энхансер может быть не примыкающим к интересующей последовательности для контроля ее экспрессии.

Термин «тропизм» относится к пути, в котором различные вирусы эволюционировали до предпочтительной направленности на конкретные виды хозяев или конкретные типы клеток в пределах этих видов.

Термин «генная терапия» относится к переносу интересующего генетического материала (например, ДНК или РНК) в организм хозяина для лечения или предотвращения генетического или приобретенного заболевания или состояния. Интересующий генетический материал кодирует продукт (например, белок, полипептид, пептид или функционирующую РНК), продукция которого in vivo желательна. Например, интересующий генетический материал может кодировать фермент, гормон, рецептор или полипептид, имеющий терапевтическую ценность.

Термин «промотор CAG» относится к сочетанию, образованному ранним энхансерным элементом цитомегаловируса и промотором β-актина цыпленка (т.е. SEQ ID NO:3). Смотрите Alexopoulou A, et al., BMC Cell Biology 2008; 9(2): 1-11.

Термин «промотор hATT» относится к промотору альфа1-антитрипсина человека (т.е. SEQ ID NO:4). Смотрите Hafenrichter H, et al., Blood 1994; 84: 3394-3404.

Термин «вирусная векторная частица» относится к генетически модифицированному вирусу, используемому для доставки генов в организм. Вирусные векторные частицы несут вирусный геном. Вирусный геном включает нуклеотидную последовательность, которая локализована между ITR в экспрессионном векторе, используемом для продукции вирусных векторных частиц. Аденоассоциированные вирусные векторные частицы называются AAV.

Термин «вектор AAV» относится к аденоассоциированным вирусным векторным частицам.

Подробное описание изобретения

В предпочтительном варианте осуществления последовательность по первому аспекту изобретения идентична по меньшей мере на 85% последовательности SEQ ID NO:1, которая кодирует белок SEQ ID NO:2. Предпочтительно идентичность последовательностей составляет по меньшей мере 87%. Более предпочтительно идентичность последовательностей составляет по меньшей мере 90%. Еще более предпочтительно идентичность последовательностей составляет по меньшей мере 95%. Еще более предпочтительно идентичность последовательностей составляет по меньшей мере 98%. Наиболее предпочтительно идентичность последовательностей составляет по меньшей мере 99%. В более предпочтительном варианте осуществления последовательность по первому аспекту изобретения представляет собой нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1. В другом варианте осуществления изобретение относится к нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1 или биологически активному варианту этой последовательности. Биологически активный вариант включает молекулу, обладающую той же самой биологической активностью, что и SEQ ID NO:1 и по меньшей мере 85% идентичностью последовательностей. Биологическая активность обозначает тот факт, что нуклеотидная последовательность SEQ ID NO:1 может транскрибироваться в матричную РНК, которая обладает повышенной стабильностью и, следовательно, дает высокие скорости трансляции, в результате чего делает возможным экспрессию высоких уровней активной сульфамидазы человека.

В предпочтительном варианте осуществления второго аспекта генетическая конструкция включает нуклеотидную последовательность, идентичную последовательности SEQ ID NO:1 по меньшей мере на 85%, предпочтительно на 87%, 90%, 95%, 98%, 99%. В более предпочтительном варианте осуществления генетическая конструкция включает нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1. Генетическая конструкция представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, в которой различные элементы сконструированы конкретным и желаемым образом. Эти элементы могут представлять собой, среди прочего, реплицирующиеся последовательности, контролирующие последовательности, кодирующие последовательности, мультиклонирующие последовательности или рекомбинантные последовательности. В предпочтительном варианте осуществления генетическая конструкция представляет собой вектор. Вектор представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, используемую для переноса генетического материала в клетку. Кроме указанного генетического материала вектор может также содержать различные функциональные элементы, которые включают, элементы, контролирующие транскрипцию, такие как промоторы или операторы, области связывания транскрипционных факторов или энхансеры, и контролирующие элементы для инициации или терминации трансляции. Векторы включают, но не ограничиваются этим: плазмиды, космиды, вирусы, фаги, рекомбинантные экспрессионные кассеты и транспозоны. Аденоассоциированные векторы (AAV) представляют собой вирусные векторные частицы, следовательно, они не являются молекулой нуклеиновой кислоты, но представляют собой генетически модифицированный вирус, используемый для доставки генов в организм.

В предпочтительном варианте осуществления второго аспекта изобретения генетическая конструкция представляет собой вектор, который используется для трансляции и транскрипции интересующего гена, обычно контролируемого промотором. Промотор представляет собой нуклеотидную последовательность, которая контролирует трансляцию интересующего гена. Промотор функционально связан с интересующим геном.

Другим предпочтительным вектором является аденоассоциированный вектор. В предпочтительном варианте осуществления аденоассоциированный вектор используется для продукции аденоассоциированных частиц на основе серотипов 1, 2, 5, 7, 8 или 9. В более предпочтительном варианте осуществления серотип представляет собой серотип 9. Аденоассоциированный вектор представляет собой вектор, происходящий из генома аденоассоциированного вируса (AAV) семейства Parvoviridae. Геном AAV построен из одноцепочечной дезоксирибонуклеиновой кислоты (ssDNA). AAV инфицирует людей, но является непатогенным (т.е. не вызывает заболевания). Эти вирусы могут инфицировать делящиеся и неделящиеся клетки, и их тропизм изменяется в зависимости от серотипа. Под серотипом понимается подразделение вирусов на группы в зависимости от их капсидных антигенов. Серотип AAV, определенный по его капсидным белкам, ограничивает тропизм вируса и позволяет ему входить в конкретный тип клеток. Продукция аденоассоциированных вирусных частиц описана ниже.

В первом предпочтительном варианте осуществления второго аспекта экспрессионный вектор включает промотор CAG, функционально связанный с SEQ ID NO:1.

Предпочтительный вектор представляет собой экспрессионный вектор, включающий промотор CAG, причем последовательность промотора представляет собой SEQ ID NO:3. Следовательно, в одном варианте осуществления второго аспекта изобретения предлагается экспрессионный вектор, включающий промотор CAG, причем последовательность промотора представляет собой SEQ ID NO:3, что подходит для лечения MPS.

Во втором предпочтительном варианте осуществления второго аспекта экспрессионный вектор включает специфичный для печени промотор hAAT, функционально связанный с SEQ ID NO:1.

Предпочтительный вектор представляет собой экспрессионный вектор, включающий специфичный для печени промотор hAAT, причем последовательность промотора представляет собой SEQ ID NO:4. Следовательно, в одном варианте осуществления второго аспекта изобретения предлагается экспрессионный вектор, включающий специфичный для печени промотор hAAT, причем последовательность промотора представляет собой SEQ ID NO:4, что подходит для лечения MPS.

Другой аспект настоящего изобретения относится к вирусной векторной частице, также называемой экспрессионным вектором, которая несет нуклеотидные последовательности по первому аспекту изобретения или генетическую конструкцию, или экспрессионный вектор по второму аспекту изобретения.

Предпочтительный экспрессионный вектор имеет серотип 1, 2, 5, 7, 8 или 9. Более предпочтительная вирусная векторная частица имеет серотип 9.

Предпочтительный экспрессионный вектор имеет серотип 9 и включает вирусный геном, включающий промотор CAG, функционально связанный с SEQ ID NO:1.

Предпочтительный экспрессионный вектор имеет серотип 8 или 9 и включает вирусный геном, включающий промотор hAAT, функционально связанный с SEQ ID NO:1.

Предпочтительный экспрессионный вектор имеет серотип 9 и включает вирусный геном, включающий промотор hAAT, функционально связанный с SEQ ID NO:1.

В предпочтительном варианте осуществления экспрессионный вектор представляет собой AAV-CAG-co-hu-SFMD и более предпочтительно AAV9-CAG-co-hu-SFMD.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления экспрессионный вектор представляет собой AAV-hAAT-co-hu-SFMD и более предпочтительно AAV8-hAAT-co-hu-SFMD или pAAV9-hAAT-co-hu-SFMD. Наиболее предпочтительный вектор, используемый, когда применяется промотор hAAT, представляет собой AAV9-hAAT-co-hu-SFMD.

В предпочтительном варианте осуществления третьего аспекта фармацевтическую композицию вводят парентеральным путем введения. Парентеральное введение относится к пути введения фармацевтической композиции в виде инъекции или инфузии. Примерами парентерального введения являются внутривенное, подкожное, внутрицистернальное и внутримышечное введение. Предпочтительно фармацевтическую композицию вводят с помощью внутривенного или внутрицистернального пути введения.

В другом предпочтительном варианте осуществления фармацевтическая композиция включает терапевтически эффективное количество нуклеотидной последовательности, генетической конструкции, вирусной векторной частицы или экспрессионного вектора по изобретению.

В предпочтительном варианте осуществления четвертого аспекта нуклеотидную последовательность, генетическую конструкцию, экспрессионный вектор, вирусную векторную частицу или фармацевтическую композицию по изобретению используют в качестве лекарства. В предпочтительном варианте осуществления они используются для повышения сульфамидазной активности в организме.

В другом предпочтительном варианте осуществления нуклеотидную последовательность, генетическую констр