Ингибиторы т-клеточной активации

Ингибиторы т-клеточной активации

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Перекрестная ссылка на родственную заявку

По данной заявке испрашивается приоритет следующей предварительной заявки США № 61/503282, которая подана 30 июня 2011 года, полное содержание которой включено в настоящий документ посредством ссылки.

Предпосылки изобретения

Клеточная терапия с использованием свежевыделенных, размноженных ex vivo или in vitro индуцированных T-регуляторных клеток в моделях аутоиммунных заболеваний или трансплантатов органов, показала, что адоптивный перенос T-регуляторных клеток может восстанавливать баланс T-регуляторных клеток по отношению к эффекторным T-клеткам, тем самым управляя аутоиммунной реакцией, ассоциированной с этими заболеваниями (Allan et al., (2008) Immunol. Rev. 223:391-421; Jiang et al., Expert review of clinical immunology 2:387-392; Riley et al., (2009) Immunity 30:656-665; Tang et al., (2012) Journal of molecular cell biology 4:11-21). Однако использование адоптивного переноса в качестве терапевтической стратегии представляет некоторые проблемы, связанные с переносом в клинику. Число аутологических T-регуляторных клеток, которые можно выделять из периферической крови человеческого субъекта, является ограниченным, а экстенсивное размножение ex vivo T-регуляторных клеток может изменять их функциональность и/или чистоту. Поскольку выделенные T-регуляторные клетки являются поликлональными, они могут проявлять функцию подавления всего иммунитета, оказываемую на нецелевые эффекторные T-клетки. Важно, что пластичность T-регуляторных клеток представляет значительную проблему (Bluestone et al., (2009) Nat Rev Immunol 9:811-816; Zhou et al., (2009a) Curr Opin Immunol 21:281-285), поскольку адаптивно перенесенные T-регуляторные клетки могут утрачивать экспрессию Foxp3 и повторно дифференцироваться в клетки Th17 (Koenen et al., (2008) Blood 112:2340-2352.) или патогенные T-клетки памяти (Zhou et al., (2009b) Nat Immunol 10:1000-1007), что повышает риск усугубления аутоиммунной реакции или воспаления.

Терапевтические средства, которые индуцируют образование T-регуляторных клеток антигенспецифическим образом in situ, будут иметь преимущества над клеточной терапией адоптивными T-регуляторными клетками. Ассоциированный с цитотоксическими T-лимфоцитами антиген-4 (CTLA-4; CD152) представляет собой точно установленный негативный регулятор T-клеточного ответа и важен для поддержания T-клеточного гомеостаза и аутотолерантности. CTLA-4 гомологичен костимуляторной молекуле CD28 и имеет те же лиганды, CD80 (B7.1) и CD86 (B7.2), которые экспрессируются на поверхности антигенпредставляющих клеток (APC). Однако неодинаковое связывание CD80/CD86 на APC с CD28 и CTLA-4 на эффекторных T-клетках ведет к противоположным исходам, причем CD28 переключает T-клеточную активацию, и CTLA-4 вызывает T-клеточное ингибирование.

Поскольку экспрессия CD28 на T-клетках носит конститутивный характер, и индукция экспрессии CTLA-4 происходит только после T-клеточной активации, с пиком через 2-3 суток (Jago et al., (2004) Clinical & Experimental Immunology, 136: 463-471), экстенсивная T-клеточная активация возникает до вовлечения CTLA-4. Таким образом, основная роль CTLA-4 состоит в том, чтобы действовать в качестве ограничения экстенсивного T-клеточного ответа вместо того, чтобы ингибировать T-клеточную активацию. Однако раннее вовлечение CTLA-4 посредством его лиганда и последующее его соединение с T-клеточным рецептором (TCR) может преждевременно тормозить передачу сигнала TCR, что вызывает ингибирование и гипореактивность T-клеток, или анергию. Эта концепция подтверждена экспериментально с использованием различных способов, включая следующие: (i) сшивка активирующих T-клетки антител (анти-CD3/анти-CD28) с использованием агонистических антител против CTLA-4 посредством совместной иммобилизации на бусах или с помощью вторичного антитела (Blair et al., (1998) J. Immunol. 160: 12-15; Krummel and Allison, (1996) J Exp Med 183:2533-2540; Walunas et al., (1996) J. Exp. Med. 183:2541-2550); (ii) молекулярное конструирование связанного с поверхностью агонистического scFv против CTLA-4 на APC (Fife et al., (2006) J. Clin. Invest. 116(8):2252-61; Griffin et al., (2001) J. Immunol. Methods. 248(l-2):77-90; Griffin et al., (2000) J. Immunol. 164(9):4433-42); и (iii) химическая сшивка антител, которые распознают специфические антигены на APC, с агонистическим антителом против CTLA-4 (Li et al., (2007). J. Immunol. 179(8):5191-203; Rao et al., (2001) Clin. Immunol. 101(2): 136-45; Vasu et al., (2004) J. Immunol. 173(4):2866-76).

Восстановление баланса T-регуляторных клеток по отношению к эффекторным T-клеткам представляет собой многообещающее средство лечения аутоиммунных заболеваний. Однако клеточная терапия, включающая перенос T-регуляторных клеток, имеет определенные ограничения. Соответственно, крайне необходимы терапевтические средства, которые индуцируют образование T-регуляторных клеток (например, CTLA-4) антигенспецифическим образом, для лечения аутоиммунного заболевания.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к лигандам, которые сшивают вовлеченный лигандом антиген-4 цитотоксических T-лимфоцитов (CTLA-4) с T-клеточным рецептором (TCR) во время ранней фазы T-клеточной активации и тем самым ослабляют передачу сигнала TCR, что ведет к T-клеточному ингибированию. Для разработки средства, которое может ингибировать T-клеточную активацию, создали биспецифический слитый белок, содержащий фрагменты, которые избирательно связывают и активируют CTLA-4 и при этом связываются с TCR. В отличие от подходов известного уровня техники биспецифический слитый белок конструировали для того, чтобы сшивать MHC с CTLA-4; затем оба связываются с TCR, образуя тримолекулярный комплекс CTLA-4/MHCII/TCR в иммунных синапсах.

Сшивка вовлеченного лигандом антигена-4 цитотоксических T-лимфоцитов (CTLA-4) с TCR с использованием биспецифического слитого белка (BsB), содержащего мутантный CD80 мыши и антиген-3 активации лимфоцитов, в аллогенном MLR аттенуированном TCR передает сигнал и направляет дифференциацию T-клеток в направлении Foxp3⁺ T-регуляторных клеток. Как описано в настоящем документе, антиген-специфические T-регуляторные клетки также можно индуцировать в антиген-специфическом окружении. Лечение мышей с диабетом, не страдающих ожирением, (NOD) коротким курсом BsB умеренно задерживало начало аутоиммунного диабета 1 типа (T1D) при временном повышении T-регуляторных клеток в крови. Однако более длительный курс лечения NOD животных с использованием BsB значительно задерживало начало заболевания, а также снижало заболеваемость животных, предрасположенных к диабету. Гистопатологический анализ поджелудочной железы мышей, которых лечили BsB, у которых не развивался диабет, выявил присутствие T-регуляторных клеток, которые были смешаны с другими CD3⁺ T-клетками и не-T-клеточными лейкоцитами около островков. Этот периинсулит ассоциировали с минимальным инвазивным инсулитом без значительного разрушения инсулин-продуцирующих β-клеток. Таким образом, бифункциональные белки, способные вовлекать CTLA-4 и MHCII и опосредованно совместно связывать их с TCR, могут индуцировать антиген-специфические T-регуляторные клетки in vivo для того, чтобы защищать мышей от T1D или других аутоиммунных заболеваний.

В частности, изобретение описывает биспецифические слитые белки, которые сшивают CTLA-4 с комплексом pMHCII. Например, описан биспецифический слитый белок, который содержит мутантный CD80 мыши (CD80w88a) и антиген-3 активации лимфоцитов (LAG-3), который конструируют для того, чтобы параллельно вовлекать CTLA-4 и сшивать его с TCR через pMHCII. В первом аспекте, следовательно, предоставлено биспецифическое биологическое средство, которое содержит лиганд, специфичный к CTLA-4, и лиганд, специфичный к комплексу pMHC.

В одном из аспектов изобретение относится к биспецифическому биологическому средству, которое содержит лиганд, специфичный к CTLA-4, и лиганд, специфичный к комплексу pMHC. Биспецифическое биологическое средство в соответствии с изобретением способно сшивать CTLA-4, присутствующий на T-клетках, с комплексом пептид-MHC (pMHC) на антигенпредставляющих клетках (APC). Комплекс пептид-MHC связывает когнатный T-клеточный рецептор (TCR) на T-клетках, что обозначает, что биспецифическое биологическое средство в соответствии с изобретением дает начало тройному комплексу CTLA-4/MHC/TCR.

В различных вариантах осуществления аспектов, обозначенных в настоящем документе, лиганд, специфичный к CTLA-4, выбирают из антитела, специфичного к CTLA-4, и CD80 (B7-1) или CD86 (B7-2). В конкретном варианте осуществления антитело, специфичное к CTLA-4, и CD80 (B7-1) или CD86 (B7-2) представляет собой агонистическое антитело. Антитела, специфичные к CTLA-4, можно конструировать, и CD80 и CD86 представляют собой природные лиганды для CTLA-4. В одном из аспектов используют CD80 или его мутант, поскольку CD80 предпочтительно связывается с CTLA-4 по отношению к CD28 и, таким образом, способствует T-клеточной инактивации, в противоположность активации.

В различных вариантах осуществления аспектов, обозначенных в настоящем документе, лиганд, специфичный к комплексу pMHC, можно выбирать из анти-MHC антитела и LAG-3. Полипептид LAG-3 представляет собой природный лиганд для белка MHCII. В одном из вариантов осуществления MHC представляет собой MHC-II (который взаимодействует CD4⁺ T-клетками). В другом варианте осуществления MHC представляет собой MHC-I, который взаимодействует с CD8⁺ T-клетками.

В биспецифическом биологическом средстве в соответствии с изобретением, лиганд, специфичный к CTLA-4, и лиганд, специфичный к комплексу pMHC, предпочтительно разделены посредством линкера. Линкер может принимать форму одного или нескольких из полиаминокислотной последовательности и Fc-домена антитела. Подходящая полиаминокислотная последовательность представляет собой G9 (Gly-9).

В различных вариантах осуществления аспектов, обозначенных в настоящем документе, лиганд, специфичный к CTLA-4, представляет собой CD80 или его мутант, в который вводят мутации для повышения специфичности к CTLA-4 по отношению к CD28. В одном из вариантов осуществления мутировавший CD80 содержит одну или несколько мутаций, выбранных из W88A, K75G, K75V, S112G, R126S, R126D, G127L, S193A и S204A, использую нумерацию последовательности в предшественнике CD80 мыши, или их аналоги CD80 человека (W84A, K71G, K71V, S109G, R123S, R123D, G124L, S190A и S201A) и дополнительно R63A, M81A, N97A, E196A.

В одном из вариантов осуществления биспецифическое биологическое средство содержит CD80, который содержит мутацию W84A (человек) или W88A (мышь).

В конкретном варианте осуществления лиганд, специфичный к комплексу MHCII, представляет собой LAG-3. Предпочтительно, в LAG-3 вводят мутации для повышения специфичности к pMHCII. Например, LAG-3 содержит одну или несколько мутаций, выбранных из R73E, R75A, R75E и R76E (Huard et al., (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94(11): 5744-5749. В одном из вариантов осуществления LAG-3 содержит мутацию R75E.

Предпочтительное связывание биспецифического слитого белка с CTLA-4 по отношению к CD28 достигали с использованием мутантного CD80 (CD80w88a), который содержит аланин вместо триптофана в аминокислоте 88 (нумерация по CD80 мыши), в качестве лиганда. CD80w88a связывает CTLA-4, но проявляет минимальную аффинность к CD28 (Wu et al., (1997), J. Exp. Med. 185:1327-1335).

Ген-3 активации лимфоцитов (LAG-3), природный лиганд MHCII, был выбран в качестве другого связывающего компонента биспецифического слитого белка (Baixeras et al., (1992) J. Exp. Med. 176:327-337; Triebel et al., (1990) J. Exp. Med. 171:1393-1405). Авторы настоящего изобретения показали, что слитый белок с такой двойной функциональностью эффективно ингибирует T-клеточную активацию и стимулирует продукцию противовоспалительных цитокинов IL-10 и TGF-β. Что более важно, этот биспецифический слитый белок также направляет дифференциацию T-клеток в высоко супрессорные Foxp3⁺ T-регуляторные клетки. Этого не происходит, когда взамен использовали точно установленный костимуляторный ингибитор CTLA-4Ig (Bluestone et al., (2006) Immunity 24:233-238; Linsley and Nadler (2009) Immunol. Rev. 229:307-321). Следовательно, раннее вовлечение CTLA-4 и сшивка CTLA-4 с TCR во время T-клеточной активации может оказывать активное влияние на дифференциацию T-клеток. Такие биспецифические слитые белки могут, таким образом, представлять новый класс биологических средств, которые можно использовать для управления чрезмерными T-клеточными ответами при аутоиммунных заболеваниях.

Во втором аспекте изобретения предоставлено применение биспецифического биологического средства, которое содержит лиганд, специфичный к CTLA-4, и лиганд, специфичный к комплексу pMHC, согласно первому аспекту изобретения, для толеризации T-клетки посредством приведения указанных T-клеток в контакт с антигенпредставляющими клетками, которые представляют пептид, полученный из указанного антигена, в комплексе с молекулой MHC и указанным биспецифическим биологическим средством.

В третьем аспекте предоставлено применение биспецифического биологического средства, которое содержит лиганд, специфичный к CTLA-4, и лиганд, специфичный к комплексу pMHC, согласно первому аспекту изобретения, в лечении заболевания, выбранного из аутоиммунного заболевания и отторжения трансплантата.

Например, аутоиммунное заболевание представляет собой диабет 1 типа (T1D), системную красную волчанку (SLE), ревматоидный артрит (RA) и воспалительное заболевание кишечника (IBD) (включая язвенный колит (UC) и болезнь Крона (CD)), рассеянный склероз (MS), склеродермию и другие заболевания и нарушения, такие как PV (пузырчатка обыкновенная), псориаз, атопический дерматит, глютеновая болезнь, хроническое обструктивное заболевание легких, тиреоидит Хашимото, базедова болезнь, синдром Шегрена, синдром Гийена-Барре, синдром Гудпасчера, болезнь Аддисона, гранулематоз Вегенера, первичный склероз желчных путей, склерозирующий холангит, аутоиммунный гепатит, ревматическая полимиалгия, феномен Рейно, височный артериит, гигантоклеточный артериит, аутоиммунная гемолитическая анемия, пернициозная анемия, узелковый полиартериит, болезнь Бехчета, первичный биллиарный цирроз, увеит, миокардит, ревматическая лихорадка, анкилозирующий спондилит, гломерулонефрит, саркоидоз, дерматомиозит, миастения гравис, полимиозит, очаговая алопеция и витилиго.

В четвертом аспекте предоставлен способ толеризации T-клеток к антигену, который включает приведение указанных T-клеток в контакт с антигенпредставляющими клетками, которые представляют пептид, полученный из указанного антигена, в комплексе с молекулой MHC и биспецифическим биологическим средством согласно первому аспекту изобретения.

В пятом аспекте предоставлен способ лечения субъекта, страдающего от состояния, выбранного из аутоиммунного заболевания и отторжения трансплантата, включающий стадии введения нуждающемуся в этом субъекту биспецифического биологического средства, содержащего лиганд, специфичный к CTLA-4, и лиганд, специфичный к комплексу pMHC, согласно первому аспекту изобретения.

Например, аутоиммунное заболевание представляет собой диабет 1 типа (T1D).

Описание фигур

Фиг.1. Конструкции BsB и BsBΔ. (A) Схематические изображения слитых белков BsB (биспецифические биологические средства) и BsBΔ. (B) Схематическое изображение pMHCII, TCR и костимуляторных молекул в иммунном синапсе, а также предложенная схема для BsB-опосредованной сшивки CTLA-4 с TCR через тримолекулярный комплекс CTLA-4/MHCII/TCR. Слитый белок вовлекает CTLA-4 и опосредованно лигирует TCR через связывание с MHCII в иммунном синапсе. Две сплошные стороны треугольника обозначают сшивку MHCII и CTLA-4, а также MHCII и TCR; штриховая сторона обозначает лигирование CTLA-4 с TCR. Пунктирная линия обозначает ингибирование передачи сигнала TCR посредством BsB-вовлеченного CTLA-4. (C). Схематическое изображение, которое показывает, что действие BsBΔ схоже с таковым BsB, за исключением того, что он нестабильно лигирует TCR.

Фиг.2. Ингибирование аллогенной T-клеточной активации посредством BsB в реакции смешанной культуры лимфоцитов. Наивные T-клетки мышей C57BL/6 и обработанные LPS и облученные APC BALB/c смешивали с тестовыми конструкциями в течение 2 суток. Затем среды для культивирования собирали и анализировали на IL-2. Только BsB и CTLA-4Ig ингибировали T-клеточную активацию, на что указывает сниженное количество IL-2 в средах. Фигура представляет более пяти независимых, но схожих исследований.

Фиг.3. Индукция Foxp3⁺ T-регуляторных клеток и образование IL-10 и TGF-β посредством BsB. (A) Аллогенные реакции смешанных культур лимфоцитов устанавливали, как описано в легенде к фиг.2, с использованием наивных CD4⁺CD62L^hiCD25^-GFP" клеток, которые выделяли у мышей с введенным Foxp3-EGFP в присутствии тестовых конструкций. Через пять суток после активации CD4⁺ T-клетки анализировали на экспрессию GFP посредством проточной цитометрии. T-регуляторные клетки отбирали как GFP⁺ и CD25⁺ клетки. Только обработка BsB вела к экспрессии GFP, что указывает на индукцию Foxp3⁺ T-регуляторных клеток (средний левый график). Среды для культивирования собирали для анализа цитокинов (правые графики), который выявлял повышенные уровни IL-10 и TGF-β в присутствии BsB. Данные репрезентативно отражают множество независимых, но схожих исследований. (B) Необходимость аутокринного TGF-β для индукции T-регуляторных клеток показана посредством полного блокирования индукции T-регуляторных клеток в присутствии блокирующего антитела к TGF-β, тогда как контрольное Ab не оказывало заметного влияния на индукцию T-регуляторных клеток.

Фиг.4. BsB-опосредованная индукция антиген-специфических T-регуляторных клеток in vitro. (A) Индукция Ova_233-339-специфичных T-регуляторных клеток in vitro. Наивные T-клетки OT-II смешивали с активированными LPS и облученными сингенными APC в присутствии 0,5 мкг/мл пептида Ova_233-239. Затем контрольный mIgG2a, BsB и BsB плюс антитело против TGF-β (aTGF-β) добавляли и проводили тестирование, как показано (левые графики). Клетки культивировали в течение 5 суток и затем метили антителами против CD25 и против Foxp3 перед анализом посредством проточной цитометрии. Уровни IL-2, IL-10 и TGF-β в средах для культивирования анализировали посредством ELISA (правые графики). (B) Мониторинг пролиферации индуцированных T-регуляторных клеток. Исследования проводили, как в A, за исключением того, что наивные T-клетки OT-II предварительно метили CFSE перед смешиванием с APC. Клетки сортировали по флуоресцентным каналам Foxp3 и CFSE.

Фиг.5. Функция подавления BsB-индуцированных T-регуляторных клеток. (A) BsB- или TGF-β-индуцированные T-регуляторные клетки очищали посредством проточной цитометрии и смешивали с меченными CFSE наивными реактивными T-клетками, полученными от мышей C57BL/6 в указанных соотношениях в трансвеллах (залитые столбцы) или обычных культуральных лунках (заштрихованные столбцы). Обработанные LPS аллогенные APC от BALB/c добавляли для стимуляции T-клеточной активации. Результаты (среднее + стандартное отклонение) отражают процентную долю пролиферирующих реактивных T-клеток (реактивные T-клетки), основываясь на разведении CFSE без T-регуляторных клеток (только реактивные T-клетки + APC), принятом за 100%. (B) Антитела против IL-10 и против TGF-β добавляли в клетки в обычные культуральные лунки при соотношении реактивных T-клеток и T-регуляторных клеток 1:1 для определения вклада цитокинов в T-клеточную пролиферацию. Антитела против TGF-β частично ингибировали функцию подавления TGF-β-индуцированных T-регуляторных клеток (левый график), но не влияли на BsB-индуцированные T-регуляторные клетки (правый график). Фигура представляет более трех независимых, но схожих исследования.

Фиг.6. Понижающая регуляция фосфорилирования AKT и mTOR посредством BsB. Наивные T-клетки культивировали в круглодонных 96-луночных планшетах, совместно покрытых антителами против CD3, против CD28 и BsB, IgG (mIgG) мыши или PD-L1 (mPD-L1) мыши в течение 18 ч. Клетки, которые полагали неактивированными, культивировали в лунках, покрытых только IgG. Затем осуществляли мониторинг состояния фосфорилирования AKT и mTOR посредством проточной цитометрии после окрашивания флуоресцентно меченными антителами к фосфорилированным AKT и mTOR. MFI обозначает среднюю интенсивность флуоресценции. На этой фигуре представлен один из трех независимых экспериментов.

Фиг.7. Постоянная экспрессия Foxp3 в T-регуляторных клетках в ответ на непрерывную стимуляцию с использованием BsB. Круглодонные 96-луночные планшеты совместно покрывали антителами против CD3, против CD28 и BsB или IgG мыши. Наивные T-клетки от мышей с введенным Foxp3-EGFP культивировали в течение 5 суток для того, чтобы индуцировать T-регуляторные клетки (левые графики), которые затем очищали от обработанных BsB клеток (красный квадрат) и повторно стимулировали в другом раунде культивирования в совместно покрытых лунках, как указано выше, в течение 5 суток, до анализа GFP⁺ клеток посредством проточной цитометрии. Повторное культивирование очищенных T-регуляторных клеток с использованием контрольного IgG мыши в течение 5 суток вело к утрате экспрессии Foxp3⁺ в ~60% клеток (правый верхний квадрант верхнего правого графика), тогда как менее чем 7% T-регуляторных клеток, которые повторно культивировали с BsB, утратили экспрессию Foxp3⁺ (верхний правый квадрант нижнего правого графика). На этой фигуре представлен один из трех независимых экспериментов.

Фиг.8. Фармакокинетика BsB in vivo и биохимический анализ. (A) Фармакокинетический профиль BsB у мышей. Нормальным мышам C57BL/6 (n=5) дозировали интраперитонеально 20 мг/кг BsB. Образцы крови собирали в различные указанные моменты времени, и уровни BsB определяли с использованием ELISA. (B) Сравнение связывания BsB и IgG2a мыши с FcRn. FcRn иммобилизовали на чипе Biacore. BsB или контрольное IgG2a мыши загружали на чип в различных концентрациях и затем регистрировали сигналы.

Фиг.9. Анализ аспарагин-связанного гликозилирования на BsB. Аминокислотную последовательность BsB отправляли на сервер NetNGlyc 1.0 для предсказания Asn-связанных участков гликозилирования. Предсказывали всего 10 Asn-связанных участков гликозилирования (обозначены N); другие аминокислоты представлены точками. также получали моносахаридную композицию BsB для определения композиции гликанов фукозы (Fuc), N-ацетилглюкозамина (GlcNAc), галактозы (Gal), маннозы (Man), сиаловой кислоты (N-ацетилнейраминовая кислота). Отношение сиаловой кислоты к галактозе, равное 0,68, указывает на то, что приблизительно треть остатков галактозы доступна для связывания с асиалогликопротеиновым рецептором.

Фиг.10. Лечение не страдающих диабетом (NOD) мышей с использованием BsB задерживало начало диабета 1 типа (T1D) в рамках парадигмы позднего профилактического лечения. (A) Уровни Foxp3⁺ T-регуляторных клеток в крови обработанных BsB NOD (сплошные круги, n=15) и обработанных физиологическим раствором контрольных NOD мышей (сплошные треугольники, n=14). Имело место умеренное, но значимое повышение числа T-регуляторных клеток у обработанных BsB животных относительно того, что отмечали у контрольных животных. (B) Кумулятивные заболеваемости манифестным диабетом у NOD животных, которых лечили с использованием BsB (заполненные круги) или физиологическим раствором (заполненные треугольники).

Фиг.11. Лечение NOD мышей с использованием BsB задерживало начало T1D в рамках парадигмы раннего профилактического лечения. (A) Уровни Foxp3⁺ T-регуляторных клеток в крови мышей, которых лечили с использованием BsB (сплошные круги, n=10), физиологическим раствором (сплошные треугольники, n=10), CTLA-4Ig (сплошные квадраты, n=10) и IgG2a мыши (пустые квадраты, n=10). Не обнаруживали повышение числа Foxp3⁺ T-регуляторных клеток после двух недель лечения с использованием BsB по сравнению с контрольными животными, которые лечили физиологическим раствором или mIgG2a. Однако лечение с использованием CTLA-4Ig вело к статистически значимому снижению числа Foxp3⁺ T-регуляторных клеток в крови. (B) Кумулятивные заболеваемости манифестного диабета у животных, которых лечили с использованием BsB, или контрольных животных. Лечение с использованием BsB вело к значительной задержке начала T1D по сравнению с контрольными группами, которые лечили физиологическим раствором или IgG2a мыши, до возраста 24 недели (p=0,04). Однако не отмечали значительной разницы между группами в конце исследования. Данные представляют одно из двух отдельных исследований со схожими результатами, где в каждой группе присутствовало всего 26 NOD мышей.

Фиг.12. Длительное лечение NOD мышей с использованием BsB значительно задерживало начало T1D у NOD мышей. (A) Кумулятивные заболеваемости манифестным диабетом у мышей, получавших лечение с использованием BsB (n=16) и не получавших лечение (n=16). Лечение с использованием BsB значительно снижало заболеваемость T1D по сравнению с теми, которых лечили физиологическим раствором (p<0,01). (B) Гистопатологический анализ тканей поджелудочной железы от животных, которых лечили физиологическим раствором или BsB. Изображения a-c представляют срезы от мышей, которых лечили физиологическим раствором, которые оставались не страдающими диабетом, с использованием H&E, антитела к инсулину, или антитела против CD3 и бокса Forkhead P3 (Foxp3), соответственно. Схожие наблюдения отмечали у NOD мышей, которых лечили с использованием BsB, которые оставались не заболевшими. На любом из срезов не отмечали свидетельства инфильтрации или инсулита; может присутствовать некоторое количество Foxp3⁺ T-регуляторных клеток (стрелки на изображении c). Изображения d-f представляют срезы поджелудочной железы от NOD животных с диабетом. Инвазивный инсулит был ясно виден, а инсулин-продуцирующие β-клетки были полностью разрушены (e). Также обнаруживали некоторые CD3⁺ T-клеточные инфильтрации, наряду с некоторыми T-регуляторными клетками и множеством не-T-клеточными лейкоцитами с голубыми ядрами (f). На изображениях g-i показаны островки, демонстрирующие характерный периинсулит, у животных, которых лечили с использованием BsB и которые остались не страдающими диабетом. Лейкоцитарные инфильтрации отмечали, но они были ограничены периферией островков. Кроме того, заметные разрушения инсулин-продуцирующих β-клеток отсутствовали. Большинство лейкоцитов на периферии не являлось T-клетками (голубые ядра). Увеличенная вкладка (изображение j, которое представляет красный квадрат на i) показывает, что Foxp3⁺ T-регуляторные клетки (стрелка с желтым кончиком) были смешаны с другими CD3⁺ T-клетками и не-T-клеточными лейкоцитами (голубые ядра) на периферии островков. Изображения получали с использованием объектива 40×; вкладку получали с использованием объектива 60×, которую затем дополнительно увеличивали 3× цифровым способом.

Подробное описание изобретения

Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют то же значение, в каком их обыкновенно понимает специалист в той области, к которой относится это изобретение. Какие-либо способы и материалы с функцией, подобной или эквивалентной той, которая описана в настоящем документе, можно использовать при практическом осуществлении или тестировании настоящего изобретения. Далее описаны способы, устройства и материалы, подходящие для такого использования. Все публикации, цитируемые в настоящем документе, включены в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме с целью описания и раскрытия технологий, реактивов и инструментов, о которых сообщается в публикациях и которые можно использовать применительно к изобретению.

Способы по настоящей заявке в целом осуществляют согласно стандартным способам, хорошо известным специалистам в данной области, и как описано в различных общих и более специфических источниках, которые цитированы и раскрыты на всем протяжении данного описания, если не указано иное. Такие способы полностью описаны в литературе. См., например, Gennaro, A.R., ed. (1990) Remington's Pharmaceutical Sciences, 18-е издание, Mack Publishing Co.; Hardman, J.G., Limbird, L.E., and Gilman, A.G., eds. (2001) The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10-е издание, McGraw-Hill Co.; Colowick, S. et al., eds., Methods In Enzymology, Academic Press, Inc.; Weir, D.M., and Blackwell, C. C, eds. (1986) Handbook of Experimental Immunology, тома I-IV, Blackwell Scientific Publications; Maniatis, T. et al., eds. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, тома I-III, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F.M. et al., eds. (1999) Short Protocols in Molecular Biology, 4-е издание, John Wiley & Sons; Ream et al., eds. (1998) Molecular Biology Techniques: An Intensive Laboratory Course, Academic Press; Newton, C.R., and Graham, A., eds. (1997) PCR (Introduction to Biotechniques Series), 2-е издание, Springer-Verlag.

Термин «антитело», если не указано иное, используют, чтобы отослать к целым антителам, а также антигенсвязывающим фрагментам таких антител. Например, термин охватывает четырехцепочечные молекулы IgG, а также фрагменты антител.

Как используется в настоящем документе, термин «фрагменты антител» относится к частям интактного полноразмерного антитела, таким как антигенсвязывающая или вариабельная область интактного антитела. Примеры фрагментов антител включают фрагменты Fab, Fab', F(ab)2 и Fv; диатела; линейные антитела; молекулы одноцепочечных антител (например, scFv); фрагменты полиспецифических антител, таких как биспецифические, триспецифические и полиспецифические антитела (например, диатела, триатела, тетратела); слитые белки иммуноглобулинов со связывающими доменами; камелизованные антитела; миниантитела; хетатирующие рекомбинантные антитела; триотела или диатела; интраантитела; нанотела; иммунофармацевтические средства на основе модульных белков малого размера (SMIP), содержащие V_HH антитела; и какие-либо другие полипептиды, сформированные из фрагментов антител, например, как дополнительно описано ниже.

Антитела могут относиться к любому классу, например, IgG, IgA или IgM; и к любому подклассу, например, IgG1 или IgG4. Различные классы и подклассы иммуноглобулинов имеют различные свойства, которые могут быть полезны в различных применениях.

Специфичность в контексте настоящего изобретения требует того, чтобы заявленное антитело было способно избирательно связывать свой определенный когнатный антиген, который представляет собой или CTLA-4 или комплекс pMHC.

Встречающиеся в природе иммуноглобулины имеют обыкновенную коровую структуру, в которой две идентичные легкие цепи (приблизительно 24 кДа) и две идентичные тяжелые цепи (приблизительно 55 или 70 кДа) образуют тетрамер. Аминоконцевая часть каждой цепи известна как вариабельная (V) область, и ее можно отличать от более консервативных константных (C) областей остальной части каждой цепи. В вариабельной области легкой цепи (также называемой доменом V_L) присутствует C-концевая часть, известная как J-область. В вариабельной области тяжелой цепи (также называемой доменом V_H) присутствует D-область в дополнение к J-области. Большинство вариаций аминокислотных последовательностей в иммуноглобулинах ограничено тремя отдельными местоположениями в V-областях, известными как гипервариабельные области или определяющие комплементарность области (CDR), которые непосредственно участвуют в связывании антигена. Если идти от аминоконца, эти области обозначают CDR1, CDR2 и CDR3, соответственно. CDR остаются на месте за счет более консервативных каркасных областей (FR). Если идти от аминоконца, эти области обозначают FR1, FR2, FR3 и FR4, соответственно. Местоположения областей CDR и FR и система нумерации определены авторами Kabat et al. (Kabat, E.A., et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, пятое издание, U.S. Department of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office, и более новые версии публикации можно найти в сети.

Гуманизированное моноклональное антитело, как обозначают в настоящем документе, представляет собой антитело, которое состоит из каркаса антитела человека, в которой встроены CDR из не принадлежащего человеку антитела. Процедуры для конструирования и получения гуманизированных антител хорошо известны в данной области и описаны, например, в Cabilly et al., патенте США № 4816567; Cabilly et al., европейской патентной заявке 0 125 023; Boss et al., патенте США № 4816397; Boss et al., европейской патентной заявке 0120694; Neuberger, M.S. et al., WO 86/01533; Neuberger, M.S. et al., европейской патентной заявке 0194276 B1; Winter, патенте США № 5225539; Winter, европейской патентной заявке 0239400; Padlan, E.A. et al., европейской патентной заявке 0519596. Дополнительные подробности об антителах, гуманизированных антителах, сконструированных антителах человека и способах их получения можно найти в Kontermann, R. and Dtibel, S. eds. (2001, 2010) Antibody Engineering, 2-е издание, Springer-Verlag, New York, NY, 2001.

Константные области можно извлекать из любых константных областей антител человека. Типично, гены вариабельной области клонируют в экспрессирующие векторы с сохранением рамки считывания генов константной области, чтобы экспрессировать тяжелые и легкие цепи иммуноглобулинов. Такие экспрессирующие векторы можно переносить в антителопродуцирующие клетки-хозяева для синтеза антител.

Необходимые вариабельные и константные области антител можно получать из баз данных о последовательностях. Например, последовательности иммуноглобулинов доступны в базе данных IMGT/LIGM (Giudicelli et al., (2006) Nucleic Acids Res. 34:(suppl. 1):D781-D784) или VBase (vbase.mrccpe.cam.ac.uk).

«Нуклеиновые кислоты», как обозначают в настоящем документе, типично включают молекулы ДНК, которые кодируют антитела по изобретению. Предпочтительными являются экспрессирующие векторы, которые подходят для экспрессии генов антител в клетке-хозяине. Экспрессирующие векторы и клетки-хозяева для экспрессии генов антител известны в данной области; см., например, Morrow, K.J. (2008) Genetic Engineering & Biotechnology News. (June 15, 2008) 28(12) и Backliwal, G., et al. (2008) Nucleic Acids Res. 36(15): e96-e96.

«CD80», как используется в настоящем документе, относится к антигену млекопитающего CD80, а также к его мутантам, которые обладают повышенной авидностью или специфичностью связывания с CTLA-4. См. Linsley et al., (1994) Immunity 1:793-801, и Wu et al., (1997) J. Exp. Med. 185(7):1327-1335, которые включены в настоящий документ посредством ссылки. CD80 млекопитающих можно выбирать из CD80 грызунов, таких как мышь, или человека.

«CD86», как используется в настоящем документе, относится к антигену CD86 млекопитающего, а также к его мутантам, которые имеют повышенную авидность или специфичность связывания с CTLA-4. См. Linsley et al., (1994) Immunity 1:793-801, которая включена в настоящий документ посредством ссылки. CD86 млекопитающего можно выбирать из CD86 грызунов, таких как мышь, или человека.

«CTLA-4», как используется в настоящем документе, относится к ассоциированному с цитотоксическими лимфоцитами антигену-4 млекопитающего (CTLA-4). Последовательность CTLA-4 человека можно найти в GenBank, номер доступа AAH74893.1, GI:49904741. CTLA-4 млекопитающего можно выбирать из CTLA-4 грызунов, таких как мышь, или человека.

«LAG-3», как используется в настоящем документе, относится к антигену 3 активации лимфоцитов млекопитающих (LAG-3). Последовательность LAG-3 человека можно найти в Huard et al., (1997) Proc. Natl. Acad. Sci, USA 94:5744-5749, включенной в настоящий документ посредством ссылки. LAG-3 млекопитающего можно выбирать из LAG-3 грызунов, таких как мышь, или человека.

«MHC» представляет собой комплекс, вовлеченный в представление пептидов, полученных из антигенов, посредством антигенпредставляющих клеток, который распознается посредством TCR. В определенном аспекте, MHC представляет собой MHCII, который представляет антиген CD4⁺ T-хелперным клеткам. См., например, Wucherpfennig et al., CSH Perspect. Biol. 2(4): a005140, электронная публикация 17 марта 2010 года.

Биспецифическое биологическое средство, которое можно обозначать как биспецифический лиганд, представляет собой лиганд, который способен связывать или быть связанным двумя мишенями одновременно. Биспецифические антитела известны в данной области и дополнительно описаны ниже. В контексте настоящего изобретения две мишени представляют собой молекулу CTLA-4 на T-клетке и комплекс пептид-MHC на APC. Биспецифическое биологическое средство в соответствии с изобретением может сшивать две мишени; посредством связывания pMHC с TCR в иммунном синапсе, соответствующим образом, сшивает молекулу CTLA-4 с TCR. «Биологическое средство», в целом, представляет собой биологическое терапевтическое средство или средство, которое можно использовать, inter alia, для терапевтических, диагностических и/или исследовательских целей.

Линкер представляет собой какую-либо аминокислотную последовательность, которая соединяет и разделяет два полипептидных домена в белке. В контексте биспецифического лиганда по изобретению, линкер представляет собой последовательность, которая соединяет лиганд CTLA-4 с лигандом MHC. Примерные линкеры представляют собой последовательности аминокислот, такие как полиглицин, например, Gly-9. Альтернативный линкер представляет собой Fc-область антитела. Такой линкер разносит два домена лигандов приблизительно на 120Å.

Лиганд в соответствии с изобретением может включать антитело и неантительные лиганды в какой-либо комбинации. Например, лиганд CTLA-4 может представлять собой антитело против CTLA-4, и лиганд MHC может представлять собой LAG-3. Альтернативно, CD80 можно использовать в качестве лиганда CTLA-4, в комбинации с LAG-3 или антителом против MHC. Оба лиганда могут представлять собой антитела, или оба могут представлять собой природные лиганды, CD80 и LAG-3.

Ассоциированный с цитотоксическими лимфоцитами антиген-4 (CTLA-4)

Ассоциированный с цитотоксическими T-лимфоцитами антиген-4 (CTLA-4), также известный как CD152, представляет со