Белок плазматический мембраны адипоцита, способ его получения и комплекс для запуска tyr-фосфорилирования инсулинрецепторных субстратных белков irs-1 и irs-2

Белок плазматический мембраны адипоцита, способ его получения и комплекс для запуска tyr-фосфорилирования инсулинрецепторных субстратных белков irs-1 и irs-2

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к белку плазматических мембран адипоцитов, который обладает специфическим сродством связывания к фосфоинозитолгликанам.

Роль фосфолипидов и фосфолипаз в трансмембранной передаче сигналов твердо установлена. В равной степени хорошо обоснована концепция заякоривания белков в клеточные мембраны с помощью ковалентно присоединяемого гликозилфосфатидилинозитола (GPI), причем точная химическая структура GPI-якоря определена для нескольких GPI-заякориваемых белков, таких как ацетилхолинэстераза (AchE) эритроцитов человека, Thy-1 крыс и нескольких оболочечных белков паразитов, аналогичных варианту поверхностного гликопротеина (VSG) из Trypanosoma brucei. Заякоривание липида происходит через фосфатидилинозитол (PI), который состоит из диацил- или алкилацилглицеринового типа фосфолипида. Поскольку последний встречается, в числе других, среди якорей млекопитающих и отличается от основной части PI, представленного в мембранах, можно было бы создать новые виды молекул, участвующих в образовании вторичных посредников, происходящих из GPI. Передача сигналов с помощью молекул GPI представляет особый интерес, так как данные заякориваемые липидами молекулы не пронизывают насквозь мембрану, а в большинстве случаев заключены во внешнюю половину липидного бислоя. Сигнал-опосредуемое высвобождение молекул GPI из клеточной мембраны продемонстрировано для разнообразных эндокринных и паракринных молекул, начиная от гормонов и включая факторы роста. Участие молекул GPI в трансмембранной передаче сигналов и их внутриклеточные эффекты в настоящее время установлены, однако меньше известно о сигнальном пути, ведущем к наблюдаемым метаболическим эффектам.

Идея о том, что GPI-заякориваемые молекулы обладают сигнальными свойствами, появилась из ранних экспериментов, в которых было показано, что связывание инсулина со своим рецептором активирует гидролиз молекул GPI. Идентифицировали низкомолекулярное вещество, которое имитирует некие механизмы действия инсулина на ферменты обмена веществ. Данное вещество обладает структурой инозитолгликана и образуется в плазматической мембране в результате гидролиза GPI, чувствительного к инсулину. Хотя первоначально думали, что GPI-предшественник инозитолгликанового ферментного модулятора представляет собой структурный аналог GPI-мембранного белкового якоря, существуют ясно выраженные отличия углеводной составляющей между GPI, преобразующим сигнал, и GPI-якорем мембранных белков. GPI-якорный мембранный белок неизменно состоит из триманнозной сердцевины, сопровождаемой этаноламинфосфатом, который обеспечивает соединение с С-концевой аминокислотой присоединяемого белка.

Регулируемый гидролиз GPI не ограничивается только инсулином, но наблюдается также при действии ряда других гормонов.

Практически во всех случаях стимуляция клеток гормонами или факторами роста приводит к временному высвобождению GPI-заякоренных белков из клеточной поверхности. Большинство рецепторов этих агонистов представляют собой либо тирозинкиназные рецепторы, либо рецепторы, связанные с тирозинкиназами.

Многие белки, участвующие в действии инсулина, идентифицированы на молекулярном уровне. Инсулиновый рецептор представляет собой трансмембранную тирозинкиназу, которая при активации в результате связывания с инсулином подвергается быстрому аутофосфорилированию и фосфорилирует ряд внутриклеточных субстратов, среди которых один или несколько 50-60 кДа белков, в том числе Shc, 15 кДа белок, связывающий жирную кислоту, и несколько так называемых инсулин-рецепторных субстратных белков, IRS-1/2/3/4. После фосфорилирования тирозина IRS-полипептиды действуют в качестве "стыковочных" белков для нескольких Src-гомологичных, содержащих 2 домена, адапторных молекул и ферментов, включая фосфатидилинозитол-3-киназу (PI-3-K), Grb2, SHP2, Nck, и Fyn. Взаимодействие между IRS-белками и PI-3-K происходит через регуляторную субъединицу p85 данного фермента и ведет к увеличению каталитической активности субъединицы p110. Фермент PI-3-K существенен для многих чувствительных к инсулину метаболических процессов, включая стимуляцию транспорта глюкозы и синтеза гликогена. Во всех случаях, в которых имеет место стимуляция фосфорилирования тирозина IRS-белков, имеет место и сопутствующая «стыковка» этих белков с субъединицей p85 фермента PI-3-K, и, за исключением пересечения между сигнальными системами инсулина и ангиотензина, данная «стыковка» ассоциируется со стимуляцией активности PI-3-K.

Помимо идентификации преобразующих сигнал путей, идущих непосредственно из инсулинового рецептора на ниже лежащие мишени, были разграничены несколько пересечений между передачей сигнала с помощью инсулина и другими гормонами/факторами роста или различными экзогенными раздражителями, которые либо имитируют (до некоторой степени) или модулируют положительным или отрицательным образом метаболическое и/или митогенное действие инсулина на разные клеточные системы. Поскольку ни один из этих лигандов прямо не активирует киназный рецептор инсулина, их сигнальные пути могут сходиться с сигнальным путем инсулина на более дистальной сигнальной стадии. Данное свойство является общим для молекул фосфоинозитолгликанпептида (PIG-P) разного вида, например, для PIG-P, полученного из гликозилфосфатидилинозитольного якоря из дрожжей Gce1p, который в существенной степени имитирует метаболическое действие инсулина, не сопровождаемое индукцией киназной активности рецептора инсулина.

Положительное взаимное влияние фосфоинозитолгликанов (PIG) и PIG-пептидов (PIG-P) на каскадное преобразование сигнала инсулина в чувствительных к инсулину клетках-мишенях включает перераспределение гликозилфосфатидилинозитол (GPI)-заякоренных белков плазматической мембраны (GPI-белок) и дважды ацилированных нерецепторных тирозинкиназ из содержащихся в плазматической мембране, детергент-устойчивых, гликолипид-обогащенных совокупностей доменов с высоким содержанием холестерина (hcDIG) в совокупность доменов с низким содержанием холестерина (lcDIG).

В выделяемых адипоцитах крыс первичная мишень PIG-P локализована в hcDIG. Меченный радиоактивной меткой PIG-P, Tyr-Cys-Asn-NH-(CH₂)₂-O-PO(OH)O-6Manα1-2)-2Manα1-6Manα1-4GluN1-6lno-1,2-(циклический)-фосфат (YCN-PIG), а также меченный радиоактивной меткой и липолитически расщепляемый GPI-белок (lcGce1p) из Saccharomyces cerevisiae, из которого был получен YCN-PIG, насыщающим образом связываются с hcDIG, но не с lcDIG, микросомами или с общими плазматическими мембранами. Связывание и YCN-PIG, и lcGce1 является специфичным, поскольку оно полностью аннулируется либо избытком химически синтезированного немеченого YCN-PIG, или предварительной обработкой адипоцитов с помощью трипсина, и затем NaCl или N-этилмалеимида (NEM), что свидетельствует о том, что YCN-PIG распознается поверхностным рецептором клетки. Связывание PIG-P существенно увеличивается в hcDIG из адипоцитов, предварительно подвергнутых обработке с помощью GPI-специфичных фосфолипаз С, совместно с липолитическим удалением эндогенных лигандов, таких как GPI-белки/липиды. Связывание по сродству является наибольшим для YCN-PIG, за которым следует комбинация отдельных составляющих, Tyr-Cys-Asn- NH-(CH₂)₂-OH(YCN) и HO-PO(H)O-6Manα1(Manα1-2)-2Manα1-6Manα1-4GluN1-6Ino-1,2-(циклический)-фосфат (PIG37), а также пептидный вариант, YMN-PIG. PIG37 и YCN порознь демонстрируют промежуточное и низкое сродство. Инкубация адипоцитов с YCN-PIG уменьшает последующее меченье с помощью [C¹⁴]NEM 115 кДа-полипептида, высвобождаемого с клеточной поверхности последовательной обработкой трипсин/NaCl. Эти данные показывают, что в адипоцитах крыс имитирующий инсулин PIG(-P) распознается трипсин/NaCl/NEM-чувствительным 115 кДа-белком из hcDIG, который действует в качестве рецептора GPI-белков.

В одной и той же клетке, по-видимому, существует несколько видов DIG. Ямки на поверхности терминально дифференцированных клеток представляют собой специальные DIG, которые образуют колбообразные впячивания, приводимые в движение чрезмерной экспрессией маркера и структурного белка кавеолина 1-3.

Ямки, которые составляют в адипоцитах 20% площади поверхности плазматической мембраны, принимают участие в рецептор-опосредованном потоцитозе (potocytosis), эндоцитозе, трансцитозе и передаче сигнала. В выделяемых крысиных адипоцитах lcDIG с низким содержанием холестерина/кавеолина, проявляющих высокую плавучую плотность (в соответствии с градиентным центрифугированием в плотности сахарозы), могут отличаться от типичных hcDIG с высоким содержанием холестерина/кавеолина, характеризуемых низкой плавучей плотностью. Основная фракция GPI-белков, таких как Gce1 и Nuc, а также дважды ацилированных белков, таких как NRTK, нерецепторная тирозинкиназа, pp59^Lyn, локализована в hcDIG. В ответ на имитирующие инсулин стимулы, такие как синтетический PIG или сульфонилмочевина, глимепирид, и GPI-белки и NRTK перемещаются из hcDIG в lcDIG. Данное перераспределение не связано с потерей их липидной модификации.

Полярная центральная гликановая головная группа без (PIG)- или с (PIG-P)-примыкающими аминокислотами на карбоксиконце GPI-белковой полипептидной составляющей обеспечивают молекулярную основу распределения GPI-белков между hcDIG и lcDIG в основном состоянии и их перераспределение в ответ на имитирующие инсулин стимулы.

GPI-белки представляют собой антигены клеточной поверхности, эктоферменты, рецепторы или клеточные молекулы адгезии, экспрессируемые у эукариот от дрожжей до человека, и заякориваемые в наружный листок плазматической мембраны с помощью ковалентно присоединяемой гликозилфосфатидилинозитольной (GPI) липидной составляющей. Несмотря на отсутствие трансмембранного домена, они вовлечены в передачу сигнала через данную плазматическую мембрану.

Установление того факта, что GPI-белки ассоциированы с множеством специализированных липидных доменов, так называемой детергент-нерастворимой богатой гликолипидами массой, DIG, а не с особыми трансмембранными связывающими/линкерными белками, свидетельствует о возможности липид-липидных взаимодействий в качестве основного связывающего механизма передачи сигнала, опосредуемого GPI-белками.

Основным структурным элементом DIG является латеральная совокупность (глико)сфинголипидов и холестерина, которая принимает вид упорядоченной жидкости (l_o) в отличие от смежных участков неупорядоченной жидкости (l_d) в липидном бислое данной мембраны. Плазматические мембраны клеток млекопитающих содержат холестерин (30-50 мол.%) и смесь липидов преимущественно в l_d-доменах (например, фосфатидилхолины с ненасыщенными хвостовыми фракциями), а также липидов, несущих насыщенные ацильные цепи преимущественно в l_o-доменах (например, [глико]сфинголипиды и GPI-липиды). Считают, что холестерин способствует плотной упаковке липидов в l_o-доменах путем заполнения интерстициального пространства между липидными молекулами, и образование l_o-доменов отмечается лишь при определенных концентрациях холестерина.

Инсулин является чрезвычайно важным гормоном, который оказывает существенное влияние на обмен веществ в организме. В общих чертах, он усиливает анаболические процессы и подавляет катаболические процессы. В частности, он увеличивает скорость синтеза гликогена, жирных кислот и белка, и тормозит распад белка и гликогена. Жизненно важное действие гормона заключается в стимуляции клеток печени, мышц и жировых клеток для удаления из кровотока глюкозы, некоторых других сахаров и аминокислот.

Бычий инсулин состоит из двух полипептидных цепей, полипептида А, содержащего 21 АК, и полипептида В, содержащего 30 АК, которые соединены двумя -S-S- (дисульфидными мостиками). Такой же характер структуры отмечен для инсулина многих млекопитающих, в том числе и для человека.

Его структура является компактной, подобной цилиндру с только карбоксильным концом В-цепи, выступающим из остального белка. Имеется много гидрофобных остатков, которые взаимодействуют с образованием центрального гидрофобного ядра, а внешнедиспергированными являются полярные остатки на любой стороне, которые дополнительно стабилизируют данный белок. Три дисульфидных мостика, два внутрицепочечных и один межцепочечный, скрепляют данную структуру.

Общей характерной чертой биосинтеза многих белков, и особенно белков, экспортируемых из клеток, является то, что белок, продуцируемый в виде предшественника, затем модифицируется, принимая окончательную форму в период сохранения и перед высвобождением. Инсулин синтезируется группой клеток поджелудочной железы, называемых островками Лангерганса, сохраняется в гранулах и при необходимости высвобождается в кровоток.

Когда инсулин синтезируется впервые, он состоит из 100 АК единственной полипептидной цепи, состоящей из 16 АК сигнальной последовательности, В-цепи, С-цепи из 33 АК, именуемой соединительной цепью, и А-цепи. Данную структуру называют пре-проинсулином (PPI). Полагают, что сигнальная область ответственна за направление PPI из участка синтеза в ER (эндоплазматический ретикулум) данной клетки, который накапливает и пакует инсулин в виде депонируемых гранул. При помещении в ER указанный сигнальный пептид удаляется с помощью протеазного фермента.

Сахарный диабет представляет собой хроническое заболевание, которое требует обращения к врачу на протяжении длительного времени, чтобы ограничить развитие его разрушительных осложнений и уметь обращаться с ними, когда они случаются. Диабет связан с острыми и хроническими осложнениями, такими как гипогликемия, диабетический кетоацидоз и гиперосмолярный некетозный синдром.

Диабет 1 типа случается у молодых, худощавых пациентов и характеризуется отчетливой неспособностью поджелудочной железы секретировать инсулин, вследствие аутоиммунной деструкции бета-клеток. У пациентов с диабетом 1 типа при отмене инсулина наблюдают развитие кетоза и в конечном итоге - развитие кетоацидоза. Следовательно, эти пациенты зависимы от экзогенного инсулина, который поддерживает их жизнь.

Диабет 2 типа, как правило, возникает у индивидов старше 40 лет, которые обладают семейным анамнезом диабета. Диабет 2 типа характеризуется периферической инсулинорезистентностью с нарушением секреции инсулина, которая варьирует по тяжести. Данные дефекты приводят к повышенному глюконеогенезу печени, что вызывает гипергликемию натощак. Большинство пациентов (90%), у которых развился диабет 2 типа, страдают ожирением, а само ожирение связано с инсулинорезистентностью, которая ухудшает состояние диабетика.

Различные другие типы диабета, ранее названные «вторичным диабетом», вызываются другими заболеваниями или лекарственными препаратами. В зависимости от исходного рассматриваемого процесса (а именно, деструкции бета-клеток поджелудочной железы или развития периферической инсулинорезистентности), данные типы диабета ведут себя подобно диабету 1 типа или 2 типа. Наиболее обычными являются заболевания поджелудочной железы, которые разрушают бета-клетки (например, гемохроматоз, панкреатит, кистозный фиброз, злокачественная опухоль поджелудочной железы), гормональные синдромы, которые препятствуют секреции инсулина (например, феохромоцитома), либо вызванны периферической инсулинорезистентностью (например, акромегалия, синдром Кушинга, феохромоцитома), а также диабет, индуцированный лекарственным средством (например, фенитоин, глюкокортикоиды, эстрогены).

Сахарный диабет характеризуется неправильной регуляцией уровня глюкозы в сыворотке. При диабете 1 типа аутоиммунная атака на эндокринную поджелудочную железу приводит к прогрессирующему и необратимому разрушению секретирующих инсулин бета-клеток. Утрата инсулина воздействует на поглощение глюкозы восприимчивой к инсулину клеткой-мишенью и на течение обмена веществ. Диабет 2 типа имеет несколько этиологий, большей частью сказывается на клеточной резистентности к действию инсулина, и сопровождается также изменениями регуляции уровня глюкозы в сыворотке. Инсулин действует через связанный с дисульфидом гетеротетрамерный рецептор клеточной поверхности, который включает внеклеточную альфа-субъединицу, связанную с помощью дисульфидных связей с трансмембраной и внутриклеточной бета-субъединицей. При диабете 1 типа отсутствие лиганда с нормальной клеточной рецепторной структурой и функцией в большинстве случаев вызывает последующие метаболические дефекты. Гормон-заместительная терапия в виде ежедневных инсулиновых инъекций обеспечивает организм лигандом с действием на рецептор, хотя и не обязательно нормальным физиологическим образом. При диабете 2 типа резистентность к действию инсулина часто лежит в основе заболевания с некоторой резистентностью, обусловленной нарушениями рецепторного действия.

Известно, что в случае инсулинорезистентности, требуется больше инсулина для того, чтобы с помощью инсулинового рецептора запустить инсулиновый сигнальный каскад. Настоящее изобретение относится к белку клеточной мембраны адипоцитов, который способен стимулировать поглощение глюкозы в обход сигнального пути, запускаемого рецептором инсулина. Это обеспечивает действенное решение проблемы в отсутствие инструмента скринирования, чтобы идентифицировать соединения, которые могли бы действовать в качестве альтернативы инсулину.

Поэтому настоящее изобретение относится к белку плазматической мембраны адипоцита, который, по-видимому, стабилизируется благодаря одновременному присутствию плазматических мембран и/или липидных пузырьков, и/или множества доменов с высоким содержанием холестерина и/или липидных пузырьков, и который обладает специфическим сродством связывания с фосфоинозитолгликаном или фосфоинозитолгликан-пептидом, отличающимся

а] способностью запускать в адипоците tyr-фосфорилирование субстрата 1 или 2 рецептора инсулина после специфического связывания фосфоинозитолгликана или фосфоинозитолгликан-пептида с данным белком и

b] способностью стимулировать в адипоците поглощение глюкозы после специфического связывания фосфоинозитолгликана или фосфоинозитолгликан-пептида с данным белком.

Количество данного белка по сравнению с другими белками и/или стабилизирующими компонентами и/или иными соединениями (например, солями, ионом, распылителем) находится в диапазоне между 0,01-10% в пересчете на сырую массу.

Количество данного белка предпочтительно находится в диапазоне от 0,1 до 5% в расчете на влажную массу, но наиболее предпочтительно находится в диапазоне от 0,1 до 1% в пересчете на влажную массу.

В естественных условиях количество указанного белка в плазматических мембранах находится в диапазоне менее 10^-6% в пересчете на влажную массу.

В предпочтительных вариантах настоящего изобретения фосфоинозитолгликан или фосфоинозитолгликан-пептид состоит, по меньшей мере, из одного из следующих соединений:

YCN-PIG, YMN-PIG, PIG37, YCN или lcGce1.

Связывание фосфоинозитолгликана или фосфоинозитолгликан-пептида с данным белком происходит, предпочтительно, с константой связывания (K_D) от 0,001 до 10 мкМ.

Константа связывания представляет собой термодинамически упорядоченное количественное описание равновесия между диссоциированными и недиссоциированными формами комплексов между данным белком и фосфоинозитолгликаном или фосфоинозитолгликан-пептидом.

Константа связывания выражается отношением констант скорости прямой и обратной реакции. Высокие значения константы связывания (например, более 10 мМ) указывают на слабое и неспецифическое связывание, а низкие значения (например, не более чем 100 мкМ) указывают на сильное и специфическое связывание.

Константы связывания можно определить разными способами, например, с помощью равновесного диализа, спектроскопии или графическими методами (Scatchard-Plot).

Что касается плазматической мембраны адипоцита, то она предпочтительно происходит от крысы, мыши или человека.

Молекулярная масса данного белка находится между 100-120 кДа, предпочтительно между 110-120 и наиболее предпочтительно равна 115 кДа. Следует отметить, что определение молекулярной массы белков любым способом, в частности с помощью SDS-ПААГ, имеет место с неопределенностью ±5-10%.

Кроме того, настоящее изобретение относится к комплексу, который образуется из вышеизложенного белка настоящего изобретения и, по меньшей мере, одного соединения из следующей группы: YCN-PIG, YMN-PIG, PIG37, YCN или lcGce1.

Предпосылкой образования комплекса является специфическое связывание данного лиганда с данным белком. Полученный комплекс можно стабилизировать, создавая ионную или ковалентную взаимосвязь между лигандом и белком.

Настоящее изобретение относится также к получению белка настоящего изобретения, в котором:

а] адипоциты получают из ткани крысы, мыши или человека,

b] из п. a] выделяют плазматические мембраны адипоцитов,

c] совокупность доменов с высоким холестерином (hcDIG) получают из плазматических мембран п. b],

d] hcDIG из п. c] обрабатывают раствором трипсин/NaCl,

e] инкубационную смесь из п. d] центрифугируют и белки полученного супернатанта разделяют при помощи электрофореза в SDS-ПААГ (электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия),

f] из данного геля элюируют белковую фракцию размером 100-120 кДа и по возможности солюбилизируют раствором или суспензией, содержащими детергент или биологические мембраны.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу идентификации соединения, которое специфически связывается с белком настоящего изобретения, в котором:

a] получают фракцию клеток, которая содержит белок настоящего изобретения,

b] получают соединение,

c] фракцию клеток из п. a] приводят в контакт с соединением п. b],

d] определяют связывание данного соединения с фракцией клеток из п. a],

e] о специфичности связывания делают вывод путем сравнения результатов из п. d] с результатами эксперимента, в котором такое же соединение, что и в п. b] приводят в контакт с фракцией клеток того же вида и/или той же тканевой специфичности, что и клетки из п. a], но которая не содержит белка настоящего изобретения, указывающего, таким образом, о более высокой специфичности связывания в случае большего количества данного соединения из п. b], связывающегося с фракцией клеток, которая содержит белок настоящего изобретения, по сравнению с фракцией клеток, которая не содержит белка настоящего изобретения.

Данную фракцию клеток берут предпочтительно из адипоцитов, клеток скелетных мышц, клеток сердечной мышцы или клеток печени. Каждый вид этих клеток можно получить предпочтительно из мыши, крысы или от человека. Данная фракция клеток состоит предпочтительно из клеточных мембран любых клеток или более предпочтительно, из совокупности доменов с высоким содержанием холестерина (hcDIG). Данное соединение, которое используют для осуществления способа идентификации соединения, которое специфически связывается с белком настоящего изобретения, можно пометить радиоактивным изотопом (например, С¹⁴, Н³, Р^32, J¹²¹ и другие) или флуоресцентным маркером.

Далее, настоящее изобретение относится к способу идентификации соединения, которое специфически связывается с белком настоящего изобретения, в котором:

a] получают клетку, транспортирующую глюкозу, которая содержит белок настоящего изобретения,

b] получают соединение,

c] клетку из п. a] приводят в контакт с соединением п. b],

d] определяют связывание данного соединения с клеткой, транспортирующей глюкозу,

e] вывод о специфичности связывания делают на основании сравнения результатов из п. d] с результатами эксперимента, в котором такое же соединение, что и в п. b], приводят в контакт с транспортирующей глюкозу клеткой того же вида и/или той же тканевой специфичности, что и клетки из п. a], но которая не содержит белка настоящего изобретения, указывающего, таким образом, о более высокой специфичности связывания в случае большего количества соединения из п. b], связывающегося с транспортирующей глюкозу клеткой, которая содержит белок настоящего изобретения, по сравнению с транспортирующей глюкозу клеткой, которая не содержит белка настоящего изобретения.

Транспортирующую глюкозу клетку, которая не содержит белка настоящего изобретения, можно получить из транспортирующей глюкозу клетки, которая содержит белок настоящего изобретения путем обработки данной клетки, которая содержит белок настоящего изобретения, раствором трипсин/NaCl и/или гликозидазой.

Транспортирующая глюкозу клетка предпочтительно представляет собой адипоцит, клетку скелетной мышцы, клетку сердечной мышцы или клетку печени. Данные клетки предпочтительно берут из культуры тканей или клеток человека, мышиного или человеческого происхождения.

Данное используемое соединение предпочтительно метят радиоактивным изотопом или флуоресцентным маркером.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу идентификации соединения, которое является агонистом или антагонистом белка настоящего изобретения, в котором

a] получают транспортирующую глюкозу клетку, в которой представлен белок настоящего изобретения,

b] получают природный лиганд белка настоящего изобретения,

c] получают химическое соединение,

d] транспортирующую глюкозу клетку п. a] приводят в контакт с лигандом из п. b] и химическим соединением из п. c],

e] определяют поглощение глюкозы транспортирующей глюкозу клеткой из п. d],

f] определяют поглощение глюкозы транспортирующей глюкозу клеткой из п. d], в которой стимуляция поглощения глюкозы подразумевает агонистическую активность, а ингибирование поглощения глюкозы подразумевает антагонистическую активность соединения п. c].

Лиганд вышеприведенного способа идентификации агониста или антагониста белка настоящего изобретения предпочтительно представляет собой YCN-PIG, YMN-PIG, PIG37, YCN или lcGce1. Транспортирующая глюкозу клетка в способе идентификации агониста или антагониста белка настоящего изобретения предпочтительно представляет собой адипоцит, клетку скелетной мышцы, клетку сердца или клетку печени, и предпочтительно происходят от видов - человек, мышь или крыса.

Настоящее изобретение относится также к лекарственному средству, содержащему соединение, которое было идентифицировано способом идентификации соединения, которое связывается с белком настоящего соединения, или которое является агонистом, либо антагонистом белка настоящего изобретения, а также вспомогательные соединения для создания лекарственного средства. Данное лекарственное средство содержит в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, по меньшей мере, одно соединение из следующей группы: YCN-PIG, YMN-PIG, PIG37, YCN или lcGce1.

Данное лекарственное средство может также содержать часть или производное, по меньшей мере, одного соединения из следующей группы: YCN-PIG, YMN-PIG, PIG37, YCN или lcGce1.

Кроме того, настоящее изобретение относится к использованию соединения, которое было идентифицировано в качестве связывающегося с белком настоящего изобретения или в качестве агониста или антагониста белка настоящего изобретения, для получения лекарственного средства для лечения инсулинорезистентности или диабета.

Таким соединением может предпочтительно быть YCN-PIG, YMN-PIG, PIG37, YCN или lcGce1, или же часть либо производное одного из данных соединений.

ПРИМЕРЫ

Химический синтез PIG(-P): синтез YCN-PIG (общий метод, смотрите Фиг. 1, 2, 3)

Синтез продукта 2 (Фиг. 4; i, ii), продукт 1 (8,0 г, 20,6 ммоль) от Bachem (Hedelberg, Германия) растворяли в 200 мл пиридина, и добавляли 5 г (81,8 ммоль) этаноламина и 5 мл N-этилморфолина. После отстаивания (16 ч, комнатная температура) при перемешивании и при 5°С по каплям приливали 50 мл уксусного ангидрида. Данную реакционную смесь перемешивали (2 ч, комнатная температура), и затем концентрировали в высоком вакууме. Сконцентрированный остаток растворяли в 150 мл горячего метанола, и полученный раствор концентрировали. Затем приливали 100 мл метиленхлорида/метанола (15/1) и 200 мл н-гептан/этилацетата (2/1), и данный продукт кристаллизовали. Выход продукта 2: 6,1 г (84%) белых кристаллов с т. пл. 175°С. ТСХ (тонкослойная хроматография): метиленхлорид/метанол (9/1), R_f=0,7. МС: (M + Li)⁺=358,2, расчетное значение для C₁₆H₂₁N₃O₆, M=351,36.

Синтез продукта 3 (Фиг. 4; iii), 2,0 г палладия на угле (10% Pd) вносили в раствор продукта 2 (12,0 г, 34,0 ммоль) в 200 мл метанол/уксусной кислоты (1/1), и данную смесь гидрировали (2 ч, комнатная температура). Полученный раствор фильтровали на силикагеле и концентрировали, а остаток выделяли очисткой с помощью флэш-хроматографии (метиленхлорид/метанол/концентрированный аммиак 30/5/1). Выход продукта 3: 7,3 г (98%) желтоватого масла. ТСХ: метиленхлорид/метанол/концентрированный аммиак (30/5/1), R_f=0,5. МС: (M + Li)⁺=224,2, расчетное значение для C₈H₁₅N₃O₄, M=217,23.

Синтез продукта 4 (Фиг. 4; iv), 1,5 г (4,5 ммоль) 1(o-(циано(этоксикарбонил)-метилиден)амино-1,1,3,3-тетраметилуронийтетрафторборат (TOTU), 0,64 г (4,5 ммоль) этил-(гидроксиимино)-цианоацетата (оксим) и 1,7 мл (13,5 ммоль) N-этилморфолина вносили при 0°С с перемешиванием в раствор из 0,8 г (3,7 ммоль) продукта 3 и 2,8 г (4,5 ммоль) TrtCys(Trt)OH в диметилформамиде, и данную смесь перемешивали (2 ч, 0°С). После добавления 200 мл этилацетата данную смесь трижды промывали насыщенным раствором NaHCO₃, обезвоживали над MgSO₄ и концентрировали. Полученный остаток растирали в н-гептан/этилацетате (6/1) и этот продукт кристаллизовали. Выход продукта 4: 2,2 г (74%) белых кристаллов с т. пл. 185°С. ТСХ: метиленхлорид/метанол (15/1), R_f=0,4. МС: (M + Li)⁺=811,7, расчетное значение для C₄₉H₄₈N₄O₅S, M=805,0.

Синтез продукта 6 (Фиг. 4; v, vi), 4,0 г (5,0 ммоль) продукта 4 растворяли в 200 мл метиленхлорида. Приливали 4 мл воды и 3 мл трифторуксусной кислоты. Через 15 мин данную смесь трижды промывали насыщенным раствором NaHCO₃, обезвоживали над MgSO₄ и концентрировали с 99%-ным выходом неочищенного продукта 5. Данный неочищенный продукт растворяли в 50 мл метанола и затем каплями добавляли 0,5 мл 1 М раствора метанолята натрия. Через 15 мин приливали 50 мл метиленхлорида, и данную смесь фильтровали на силикагеле. После концентрирования отфильтрованного раствора остаток выделяли очисткой с помощью флэш-хроматографии (метиленхлорид/метанол (9/1)). Выход продукта 6: 2,2 г (85%) аморфного твердого вещества. ТСХ: метиленхлорид/метанол (5/1), R_f=0,7. МС: (M + Li)⁺=527,3, расчетное значение для C₂₈H₃₂N₄O₄S, M=520,6.

Синтез продукта 7 (Фиг. 4; vii), 2,7 г (5,2 ммоль) продукта 6, 4,2 г (10,4 ммоль) Ztyr(Bn)OH, 3,4 г (10,4 ммоль) TOTU, 1,5 г (10,4 ммоль) оксима и 2 мл N-этилморфолина в 50 мл диметилформамида аналогичным образом подвергали взаимодействию с препаратом продукта 4. Выход продукта 7: 4,2 г (89%) белых кристаллов. ТСХ: метиленхлорид/метанол (15/1), R_f=0,25. МС: (M + Li)⁺=914,8, расчетное значение для C₂₅H₅₃N₅O₈S, M=908,1.

Синтез продукта 8 (Фиг. 5; viii), 6,0 г (73 ммоль) фосфористой кислоты подвергали четырехкратному концентрированию с пиридином, после чего помещали в 180 мл безводного пиридина. При 10°С по каплям добавляли 13 мл пивалоилхлорида. Данный реакционный раствор оставляли на 45 мин при комнатной температуре. В этот реакционный раствор вводили 16,4 г (18,1 ммоль) продукта 7, как описано выше. Через 5 ч. его разбавляли с помощью 200 мл толуола и 150 мл метиленхлорид/метанол/33% NH₃ (30/10/3). После концентрирования остаток пиридина трижды перекристаллизовывали с 200 мл толуола. Данный остаток суспендировали в 200 мл метиленхлорид/метанола (20/1). Нерастворившиеся компоненты фильтровали и дважды промывали с помощью 50 мл метиленхлорид/метанола (20/1). Полученный фильтрат концентрировали и выделяли очисткой с помощью флэш-хроматографии. Выход продукта 8: 11,6 г (66%) белых кристаллов. ТСХ: метиленхлорид/метанол/33% NH₃ (30/5/1), R_f=0,25. МС: (M + Li)⁺=978,4, расчетное значение для C₅₂H₅₄N₅O₁₀SP, M=972,08.

Синтез продукта 10 (Фиг. 6; ix, x), 4,5 г продукта 8 (4,6 ммоль) и 6,0 г продукта 9 (2,3 ммоль; синтез осуществляли, как описано раньше в ссылке 47), растворяли в 80 мл безводного пиридина. Через 30 мин при комнатной температуре данную реакцию охлаждали до 0°С и добавляли 5 мл воды и 1,3 г йода. Эту реакционную смесь перемешивали (30 мин, 10°С) и затем разбавляли с помощью 500 мл метиленхлорида, 150 мл насыщенного раствора NaCl и 30 мл насыщенного раствора тиосульфата и перемешивали в течение 5 мин. Органическую фазу обезвоживали над MgSO₄ и концентрировали. Полученный остаток выделяли очисткой с помощью флэш-хроматографии с метиленхлорид/метанол/конц.NH₃ (30/5/1-30/10/3). Выход продукта 10: 8,0 г в виде аморфного твердого вещества. ТХС: метиленхлорид/метанол (20/1), R_f=0,5. МС: (M + Li)⁺=3583,6, расчетное значение для C₂₀₇H₂₁₄N₈O₄₂SP₂, M=3580,0.

Синтез продукта 11 (Фиг. 6; xi), 300 мл аммиака концентрировали при -78°С. В нем растворяли 2,1 г (91 ммоль) натрия. Данный раствор разбавляли 150 мл безводного тетрагидрофурана, после чего 8,0 г продукта 10 (2,2 ммоль) из защищенного конечного продукта, растворенного в 50 мл безводного тетрагидрофурана, медленно по каплям добавляли в реакционную смесь с температурой -78°С. Через 15 мин течения реакции (голубая окраска не должна исчезать), данную смесь осторожно обрабатывали с помощью 5 г хлорида аммония. При исчезновении голубой окраски данную смесь осторожно разбавляли с помощью 50 мл воды и 150 мл метанола. Давали ей возможность растаять, а затем концентрировали до около 100 мл. Данный раствор разбавляли с помощью 500 мл метиленхлорид/метанол/33% NH₃ (3/3/1) и вносили во флэш-силикагельную колонку (500 мл силикагеля). Ее последовательно элюировали с помощью 1 л, каждого, метиленхлорид/метанол/33% NH₃ (3/3/2) и (3/3,5/3). Затем данный элюируемый продукт хроматографировали с использованием н-бутанол/этанол/вода/33% NH₃ (2/2/2/1). Выход продукта 11: 2,4 г (67% от продукта 9) в виде белого твердого вещества. ТХС: н-бутанол/этанол/вода/33% NH₃ (2/2/2/1), R_f=0,5. МС: (M + NH₃)⁺=1572,6; расчетное значение для C₅₄H₈₈N₆O₄₀P₂S, M=1555,31. P³¹-ЯМР (D₂O)=15,3 м.д. для циклофосфата и 0,3 для эфира фосфорной кислоты. Данные для H¹- и C¹³-ЯМР представлены в Таблице 1.

Синтез продукта YCN (Фиг. 7; xii), 11,0 г (11,3 ммоль) продукта 7 подвергали снятию защиты аналогичным образом, как и препарат продукта 11. Выход YCN: 4,5 г (90%) белых кристаллов. ТСХ: метиленхлорид/метанол/концентрированный аммиак (30/15/5), R_f=0,25. МС: (M + Li)⁺=448,3, расчетное значение для C₁₈H₂₇N₅O₆S, M=441,51.

Синтез продукта YMN-PIG, YMN-PIG синтезировали с помощью той же последовательности реакций, которая представлена на Фиг. 2. Использование BocMetOH вместо TrtCys(Trt)OH давало YMN-PIG со сходным выходом в виде белого твердого вещества. ТХС: н-бутанол/этанол/вода/33% NH₃ (2/2/2/1), R_f=0,5. МС: (M + NH₃)⁺=1600,6; расчетное значение для C₅₆H₉₂N₆O₄₀P₂S, M=1583,38. P³¹-ЯМР (D₂O)=15,3 м.д. для циклофосфата и 0,3 для эфира фосфорной кислоты.

Получение радиоактивно меченого и липолитически расщепляемого Gce1p (lcGce1p)

Gce1p с интактным GPI-якорем выделяли очисткой из растущих на лактате дрожжевых клеток, которые метаболически метили с помощью мио-[C¹⁴]инозита, а затем ферментативно преобразовали в сферопласты. Плазматически мембраны получали выделением очисткой с помощью центрифугирования в градиенте фиколла, солюбилизировали с использованием 0,35% β-амидотаурохолата и подвергали TX-114-разделению. Gce1p, содержащийся в богатой детергентом фазе, выделяли очисткой с помощью гель-фильтрующей хроматографии на Сефадексе S-300, хроматографии по сродству на Сефарозе N⁶-(2-аминоэтил)-cAMP и хроматографии на фенил-Сефарозе. Элюирование с колонок сопровождалось непрерывным мониторингом H³-радиоактивности. Частично выделенный очисткой Gce1p осаждали (12% полиэтиленгликоль 6000), затем ресуспендировали в буфере G (25 мМ Трис/ацетат, рН 7,4, 144 мМ NaCl, 0,1% β-амидотаурохолат, 0,5 мМ DTT, 0,2 мМ ЭДТА, 5% глицерин, 0,1 мМ PMSF, 5 мкМ лейпептин, 1 мМ йодацетамид, 10 мкг/мл ингибитор трипсина из соевых бобов) при концентрации 0,2 мг белка/мл и впоследствии инкубировали (3 ч, 25°С) в присутствии 6 ед./мл PI-специфичного PLC (B. cereus). После добавления ледяного раствора, состоящего из 2% Тритона Х-114, 10 мМ Трис/HCl (рН 7,4), 144 мМ NaCl и отделенной фазы, (инкубирования в течение 2 мин при 37°С и центрифугирования при 12000×g в теч