Применение соединений, участвующих в биосинтезе нуклеиновых кислот в качестве криопротективных агентов

Применение соединений, участвующих в биосинтезе нуклеиновых кислот в качестве криопротективных агентов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Эта заявка испрашивает приоритет по дате предварительной заявки США № 60/484,126, поданной 2 июля 2003, и европейской патентной заявки № EP 03077079.6, поданной 2 июля 2003, раскрытие каждой из которых приведено здесь в качестве ссылки в полном объеме.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Изобретение касается области замороженных и лиофильно-высушенных микробных культур и соединений, участвующих в биосинтезе нуклеиновых кислот в качестве криопротективных агентов. Более подробно изобретение касается культур, полученных при применении таких агентов, которые, в дополнение к криопротективной активности, придают увеличенную метаболическую активность культуре при инокуляции в питательную среду для ее ферментации или преобразования. Такие замороженные или лиофильно-высушенные культуры полезны в производстве многочисленных пищевых и кормовых продуктов.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Микроорганизмы участвуют в производстве пищевых и кормовых продуктов, включая большинство молочных продуктов. Культуры бактерий, в частности культуры бактерий, обычно классифицируемых как молочнокислые бактерии, являются необходимыми в изготовлении всех ферментированных молочных продуктов, сыра и масла. Однако культуры некоторых небактериальных микроорганизмов, например некоторых дрожжей и грибов, применяются для обработки пищевых и кормовых продуктов. Культуры этих микроорганизмов часто именуются заквасочными культурами и придают специфические особенности различным молочным продуктам, выполняя множество функций. Заквасочные культуры широко применяются в различных отраслях промышленности, таких как молочная промышленность, так же как в виноделии и в сокоперерабатывающей промышленности, в мясообрабатывающей промышленности.

Культуры микроорганизмов также находят важные применения в биоконсервировании пищевых продуктов (Andersen et al., 1997).

Коммерческие молочные заквасочные культуры обычно состоят из бактерий, ферментирующих лактозу и лимонную кислоту. Молочнокислые бактерии обозначают группу грам-положительных, неподвижных, микроаэрофильных или анаэробных бактерий, которые ферментируют сахар с продукцией кислот, включая молочную кислоту. В промышленном отношении некоторые из наиболее полезных молочнокислых бактерий включают род Lactococcus, род Streptococcus, род Enterococcus, род Lactobacillus, род Leuconostoc и род Pediococcus.

Распространенные штаммы молочных заквасочных культур молочнокислых бактерий обычно разделяются на мезофильные организмы, имеющие оптимальные температуры роста около 30°C, и термофильные организмы, имеющие оптимальные температуры роста в диапазоне от приблизительно 35°C до приблизительно 45°C. Примеры организмов, принадлежащих мезофильной группе, включают Lactococcus lactis подвид lactis, Lactococcus lactis подвид cremoris, Leuconostoc mesenteroides подвид cremoris, Pediococcus pentosaceus, Lactococcus lactis подвид lactis биовар diacetylactis и Lactobacillus paracasei подвид paracasei. Термофильные штаммы молочнокислых бактерий включают, например, Streptococcus thermophilus, Enterococcus faecium, Lactobacillus delbrueckii подвид lactis, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus и Lactobacillus acidophilus.

Молочные заквасочные культуры также классифицированы по их специфическому штаммовому составу и предпочтительному производственному применению. Чистая заквасочная культура включает только единственный вид, тогда как смешанная культура включает два или несколько различных видов. Заквасочные культуры часто классифицируются по температуре, при которой они показывают оптимальный рост или максимальную ферментативную активность. Мезофильные заквасочные культуры обычно имеют оптимальную температуру приблизительно 30°C, тогда как термофильные культуры имеют оптимальную температуру приблизительно 35-45°C (Nielsen и Ullum, 1999). Примеры коммерческих мезофильных смешанных культур включают:

"О-культуру", включающую Lactococcus lactis подвид lactis и Lactococcus lactis подвид cremoris,

"D-культуру", включающую Lactococcus lactis подвид lactis, Lactococcus lactis подвид cremoris и Lactococcus lactis подвид lactis биовар diacetylactis,

"L-культуру", включающую Lactococcus lactis подвид lactis, Lactococcus lactis подвид cremoris и вид Leuconostoc,

"LD-культуру", включающую Lactococcus lactis подвид lactis, Lactococcus lactis подвид cremoris, Lactococcus lactis подвид lactis биовар diacetylactis и вид Leuconostoc.

О-культура применяется для изготовления сыра без дырок (Чеддер, Чешир, Фета). D-культура применяется для изготовления масла. L-культура применяется для изготовления сыра с маленькими дырками (например, сыра коттедж) и створоженных молочных продуктов с низкой продукцией CO₂. LD-культура применяется для изготовления сыра с нормальными размерами дырок, створоженных молочных продуктов и кисло-сливочного масла. В промышленном масштабе LD-культуры в настоящее время являются одними из наиболее применяемых смешанных культур.

Примеры коммерческих термофильных смешанных культур включают:

"Йогуртную культуру", включающую Streptococcus thermophilus и Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus, и

"Термофильную сырную культуру", включающую Streptococcus thermophilus и Lactobacillus helveticus.

Йогуртная культура применяется для изготовления йогурта и особых итальянских сыров, Термофильная сырная культура применяется для изготовления сыра Эмменталер и некоторых итальянских сыров.

Кроме того, в качестве молочных заквасочных культур, особенно в производстве сыра, часто применяются разновидности Propionibacterium. В качестве пищевых заквасочных культур обычно также применяются организмы, принадлежащие роду Brevibacterium и роду Bifidobacterium.

Другой группой микробных заквасочных культур являются грибковые культуры, включая культуры дрожжей и культуры филаментных грибов, которые являются полезными в производстве определенных сортов сыра и напитков. Примеры включают Penicillium roqueforti, Penicillium candidum, Geotrichum candidum, Torula kefir, Saccharomyces kefir и Saccharomyces cerevisiae.

Заквасочные культуры также широко применяются в мясоперерабатывающей промышленности, например для производства различных колбас и салями.

Коммерческие заквасочные культуры обычно распространяются в виде замороженных культур. При низкой температуре замороженных культур большинство метаболических процессов в клетке прекращается и клетки могут поддерживаться во взвешенном, но жизнеспособном состоянии в течение продолжительных периодов.

Коммерчески очень интересны концентрированные замороженные культуры, так как культуры могут быть инокулированы непосредственно в продукционный контейнер. При применении концентрированных замороженных культур конечный потребитель избегает иначе обязательного, отнимающего много времени промежуточного шага ферментации, в течение которого заквасочная культура увеличивается, и конечный потребитель значительно уменьшает риск контаминации. Концентрированные культуры могут называться готовыми к применению в производстве DVS™ культурами.

Как альтернатива концентрированным замороженным культурам могут быть приготовлены концентрированные лиофильно-высушенные DVS™ культуры. Эти культуры имеют дополнительное преимущество в том, что они могут перевозиться без охлаждения.

В основном возможные повреждающие воздействия замораживания и размораживания на жизнеспособность живых клеток приписывались дегидратации клетки и формированию кристаллов льда в цитозоле в процессе замораживания.

Множество криопротективных агентов считаются влияющими на концентрацию цитозоля контролируемым и минимально вредным образом так, что в процессе замораживания кристаллизация льда в цитозоле предотвращается или минимизируется.

Статья F.J. Chavarri и др. (Biotechnology letters, vol 10, 1, 11-16 (1988), "Cryoprotective agents for frozen concentrated starters from non-bitter Streptococcus Lactis strains") описывает, что жизнеспособность замороженной чистой культуры Streptococcus lactis при хранении может быть улучшена добавлением 5% лактозы или 5% сахарозы. Лактоза или сахароза действовали как криопротективные агенты. Streptococcus lactis является прежним названием Lactococcus lactis подвида lactis.

Точно так же статья R. Carcoba et al (Eur Food Res Technol (2000) 211, 433-437, "Influence of cryoprotectants on the viability and acidifying activity of frozen and freeze-dried cells of the novel starter strain Lactococcus lactis subsp. lactis CECT 5180") описывает, что жизнеспособность хранения замороженной чистой культуры Lactococcus lactis подвида lactis могла быть улучшена добавлением различных криопротективных агентов, таких как сахара (лактоза, сахароза и трегалоза), глутаминовая кислота и желатин.

Жизнеспособность лиофильно-высушенных культур может также быть улучшена при помощи криопротективных агентов. Например EP259739 описывает множество различных криопротективных агентов для лиофильно-высушенных культур.

Существовали различные подходы по обеспечению криопротекции, такие как углеводы, протеины и определенные поверхностно-активные агенты.

В общем, для получения криопротективного эффекта требуются относительно большие количества криопротективных агентов. Несмотря на то, что это представляет незначительную проблему по некоторым параметрам, это представляет значительную проблему для областей пищевой промышленности, где даже малое нежелательное отклонение во вкусе ферментированного или обработанного продукта, которое вызвано криопротективным агентом, может быть вредным. Авторы не знают ни о каких коммерчески доступных концентрированных замороженных культурах, которые содержат значительные количества криопротективных агентов.

Агенты кроме углеводов, протеинов и поверхностно-активных агентов применялись для улучшения устойчивости культур к низкой температуре.

WO 00/39281 описывает применение ИМФ и соединений, участвующих в биосинтезе ДНК, для стабилизации метаболической активности жидких заквасочных культур, но не устойчивости замороженных или лиофильно-высушенных культур.

WO 00/19817 описывает криопротективную композицию, в которой для криопротекции применяется не любой отдельный компонент, а комбинация соединений. Комбинация включает блокатор кальциевого канала, матрицу питательного вещества клетки, воду и аденозин. Однако применение фармацевтически активных соединений, таких как блокаторы кальциевого канала, не приемлемо для областей пищевой промышленности.

JP 05 308956 описывает культуральную питательную среду для культуры нитрифицирующих бактерий, которая включает высокомолекулярный полисахарид, в котором звено, состоящее из 1 молекулы альфа-L-рамнозы, 1 молекулы D-глюкуроновой кислоты и 2 молекул D-глюкозы, полимеризована линейно, и, например, АТФ. Нитрифицирующие бактерии, культивируемые в этой питательной среде, могут быть заморожены и сохранены. Нет никакого указания, что компоненты питательной среды могут функционировать как криопротективные агенты при добавлении к концентрированным культурам до замораживания.

Остается потребность в эффективных криопротективных агентах, которые могут быть добавлены к концентрированным культурам, применяемым в пищевой промышленности.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Полагалось, что не было никаких значительных проблем устойчивости при хранении для коммерчески релевантных концентрированных замороженных культур молочнокислых бактерий. Хотя общеизвестно, что большинство живых клеток страдает от замораживания и последующего размораживания, проблема жизнеспособности вообще не рассматривалась как значительная для коммерчески релевантных концентрированных замороженных культур молочнокислых бактерий. Поэтому коммерчески доступные концентрированные замороженные культуры не содержат значительных количеств криопротективных агентов. Это может быть вследствие того, что некоторые коммерческие заквасочные культуры, по-видимому, очень устойчивы к повреждающим эффектам замораживания и размораживания.

Например, множество исследований устойчивости было выполнено с коммерческими концентрированными культурами молочнокислых бактерий, которые были заморожены в течение 2-3 месяцев. 2-3-месячные замороженные культуры не показали никакого значительного ухудшения культуральной активности в течение одного года при температуре ниже -45°C. Следовательно, полагалось, что коммерчески релевантные культуры не имели значительных проблем устойчивости при хранении.

Авторы наблюдали, например, что замороженные LD-культуры имеют значительную потерю активности в пределах первых 1-3 недель хранения в замороженном состоянии (как проиллюстрировано в примере 1). Далее, после первых нескольких недель потеря активности была относительно незначительной и соответствовала предшествующим известным результатам, описанным выше.

Авторы выявили непризнанные проблемы устойчивости, касающиеся замораживания и начальной фазы хранения для некоторых типов коммерчески релевантных концентрированных замороженных культур молочнокислых бактерий, например коммерчески доступных замороженных LD-культур. В особенности, когда культуры хранятся при температуре, поддерживаемой современными промышленными морозильными аппаратами, обычно около -50°C.

Авторы выявили новый класс криопротективных агентов, которые предназначены для решения как проблемы устойчивости, так и придают увеличенную метаболическую активность культуре.

Один вариант осуществления изобретения касается концентрированной замороженной или лиофильно-высушенной культуры, где культура включает один или несколько криопротективных агентов, выбранных из группы, состоящей из одного или нескольких соединений, участвующих в биосинтезе нуклеиновых кислот, или одного или нескольких производных любых таких соединений.

Криопротективный агент предпочтительно добавляется к жизнеспособным бактериям до того, как они замораживаются или лиофилизуются.

Настоящее изобретение также предоставляет способ изготовления замороженной культуры или лиофильно-высушенной культуры, включающий следующие стадии: добавление одного или нескольких криопротективных агентов, выбранных из группы, состоящей из одного или нескольких соединений, участвующих в биосинтезе нуклеиновых кислот, или одного или нескольких производных любых таких соединений к жизнеспособным организмам; замораживание материала для получения замороженного материала и упаковывание замороженного (или лиофильно-высушенного) материала подходящим образом. В случае создания лиофильно-высушенной культуры способ включает стадию, где сублимация воды от замороженного материала происходит до стадии упаковки.

Согласно настоящему изобретению также предоставлен способ приготовления пищевых и кормовых продуктов, который включает применение культуры согласно изобретению. Предпочтительно пищевой продукт выбран из продукта на основе молока, мясного продукта, овощного продукта и напитка.

Дополнительное преимущество описанного здесь нового класса криопротективных агентов состоит в том, что они сохраняют не только жизнеспособность, но и метаболическую активность восстановленных клеток и не воздействуют на вкус ферментированного или обработанного продукта любым неблагоприятным образом.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

До обсуждения детализированных вариантов осуществления изобретения предоставлено определение специфических терминов, касающихся различных аспектов и вариантов осуществления изобретения.

Используемый здесь термин "молочнокислая бактерия" (LAB) определяет грам-положительную, микроаэроаэрофильную или анаэробную бактерию, которая ферментирует сахара с продукцией кислот, включая молочную кислоту (как преимущественно продуцируемую кислоту), уксусную кислоту и пропионовую кислоту. В промышленном отношении самые полезные молочнокислые бактерии найдены среди видов Lactococcus, видов Streptococcus, видов Lactobacillus, видов Leuconostoc, видов Pediococcus, видов Brevibacterium, Enterococcus и видов Propionibacterium. Дополнительно в группу молочнокислых бактерий обычно включают бактерии, принадлежащие группе облигатных анаэробных бактерий, бифидобактерии, то есть виды Bifidobacterium, которые часто применяются как пищевые заквасочные культуры самостоятельно или в комбинации с молочнокислыми бактериями.

Термин "концентрированная" культура относится к композиции, которая имеет количество жизнеспособных клеток (колониеобразующих единиц, КОЕ), которое составляет, по крайней мере, 10⁸ КОЕ в мл, более предпочтительно, по крайней мере, 10⁹ КОЕ в мл, более предпочтительно, по крайней мере, 10¹⁰ КОЕ в мл, более предпочтительно, по крайней мере, 10¹¹ КОЕ в мл или более предпочтительно, по крайней мере, 10¹² КОЕ в мл. Как может быть видно из примеров, концентрированная культура может, например, быть получена центрифугированием.

Термин "упаковка" должен пониматься широко. Он означает, что замороженная или лиофильно-высушенная культура упакована таким образом, что может быть предоставлена пользователю. Она может быть упакована в бутыль, тетра-пак®, пакет и т.д.

Термин "криопротективный агент" обозначает субстанцию, которая способна улучшить устойчивость к повреждающим эффектам, вызванным замораживанием и начальной фазой хранения замороженной или лиофильно-высушенной культуры. В настоящем контексте это могут быть отдельные особые криопротективные агенты или это могут быть два или несколько различных агентов. Соответственно, весовое процентное содержание криопротективного агента(ов) внутри культурального материала должно пониматься как сумма количества криопротективного агента(ов). Предпочтительный способ определения, является ли субстанция криопротективным агентом, который способен улучшить устойчивость замороженной культуры к повреждающим эффектам, вызванным замораживанием и начальной фазой хранения, заключается в разделении культуры, как описано здесь, на два образца, добавляя определенное количество криопротективного агента к одному из них, замораживая их обоих, и измерении подкисляющей активности в релевантной культуральной среде (например, молоке) в день замораживания и периодически (например, до одного года) при хранении в замороженном состоянии. Если культура с криопротективным агентом улучшила активность, изучаемую за период хранения (такую как улучшенную активность подкисления молока), субстанция является криопротективным агентом. Подходящий анализ определения активности подкисления молока дается здесь в демонстрационных примерах.

Варианты осуществления настоящего изобретения описаны ниже только в качестве примеров.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Как обсуждалось ранее, считается, что концентрированные замороженные или лиофильно-высушенные культуры являются устойчивыми. Однако, вопреки общему убеждению в этой области, авторы, к удивлению, наблюдали невыявленные до настоящего времени проблемы устойчивости, связанные с замораживанием и начальной фазой хранения для некоторых типов коммерчески релевантных концентрированных замороженных культур молочнокислых бактерий, таких как коммерчески доступные замороженные LD-культуры, см. Пример 1 ниже. Предполагается, что подобные проблемы устойчивости будут широко раскрыты, когда коммерческие замороженные или лиофильно-высушенные культуры будут адекватно тестироваться.

Для преодоления этой проблемы было протестировано множество возможных агентов, чтобы выяснить, способны ли они преодолеть проблему. Среди протестированных агентов был агент (а), выбранный из группы, состоящей из одного или нескольких соединений, участвующих в биосинтезе нуклеиновых кислот, которые предварительно были продемонстрированы авторами по улучшению устойчивости незамороженных, жидких заквасочных культур.

WO 00/39281 описывает применение ИМФ и соединений, участвующих в биосинтезе ДНК для стабилизации метаболической активности жидких заквасочных культур, но в отличие от культур, которые остаются жидкими во время охлаждения, культуры, которые замораживаются, подвергаются множеству потенциальных повреждающих проблем, которые непосредственно касаются процесса замораживания.

При температуре замерзания, когда культура начинает замораживаться, и вне- и внутриклеточно формируется лед, микроорганизмы подвергаются гибели и повреждению. Формирование льда наносит клеткам механическое повреждение и, кроме того, генерирует высокие внеклеточные осмотические давления, которые приводят к дегидратации клетки. Изменения в ионной силе и рН воды в результате замораживания также приводят к нарушению структуры и функции многочисленных клеточных компонентов и макромолекул, стабильность которых зависит от этих факторов (Adams, 2000).

Различие между проблемами устойчивости жидких в сравнении с замороженными культурами может быть далее проиллюстрировано экспериментом, о котором сообщает Mazur (1961). В этом эксперименте клетки дрожжей были погружены в ванну при -15°C. Результат был таков, что 97% клеток выжили, когда система оставалась жидкой, но только 27% клеток выжило, когда эта внешняя питательная среда замораживалась до -15°C (Mazur 1961).

Поэтому критерии, которые необходимо предоставить с помощью эффективного криопротективного агента, значительно различаются, в зависимости от того, разработан ли криопротективный агент для защиты жидких или замороженных культур, а следовательно, добавки, которые являются эффективными криопротективными агентами для жидких культур, могут быть неэффективны для замороженных культур. Один пример такой добавки - это Na-формиат. Как описано в WO 00/39281, 3% Na-формиат эффективен в увеличении устойчивости при хранении концентратов жидких заквасочных культур молочнокислых бактерий. Однако, как проиллюстрировано ниже в Примере 15, 3% Na-формиат уменьшает устойчивость при хранении замороженной заквасочной культуры молочнокислых бактерий.

Поэтому было совершенно удивительно, когда эксперименты показали, что ИМФ и некоторое соединение(я), участвующие в биосинтезе нуклеиновых кислот, улучшали устойчивость и замороженных, и лиофильно-высушенных концентрированных культур.

Как показано ниже в Примере 2, добавление одного такого соединения, инозин-5'-монофосфата (ИМФ), значительно улучшает устойчивость к повреждающим эффектам, индуцированным замораживанием и начальной фазой хранения. Дополнение ИМФ также значительно улучшает устойчивость лиофильно-высушенной культуры, как проиллюстрировано ниже в примере 9. Ниже, из примера 10 ясно, что в качестве криопротективных агентов являются эффективными не только ИМФ, но и более широкий диапазон агентов, выбранных из группы, состоящей из соединения(ий), участвующего в биосинтезе нуклеиновых кислот.

Как проиллюстрировано в примере 10, и нуклеотиды, и нуклеозиды могут быть применены как криопротективные агенты. Таким образом, в предпочтительных вариантах осуществления криопротективное соединение, полезное по улучшению устойчивости к повреждающим эффектам, вызванным замораживанием и начальной фазой хранения заквасочной культуры, является соединением, выбранным из группы, включающей соединение, участвующее в биосинтезе нуклеиновых кислот, включая группу пуриновых оснований, пиримидиновых оснований, нуклеозидов и нуклеотидов. Примерами подобных соединений являются инозин-5'-монофосфат (ИМФ), аденозин-5'-монофосфат (АМФ), гуанозин-5'-монофосфат (ГМФ), уранозин-5'-монофосфат (УМФ), цитидин-5'-монофосфат (ЦМФ), аденин, гуанин, урацил, цитозин, гуанозин, уридин, цитидин, гипоксантин, ксантин, гипоксантин, оротидин, тимидин, инозин и производное любых таких соединений или их смеси.

Описанный ранее WO 00/19817 предоставляет в качестве криопротективной композиции композицию блокатора кальциевого канала, матрицы питательного вещества клетки, воды и аденозина, однако возможная криопротективная активность отдельных компонентов, таких как, например, аденозин, не была обсуждена. Однако аденозин, возможно, неэффективен в качестве криопротективного агента, как проиллюстрировано в примере 12 и 15, где аденозин производит впечатление снижения устойчивости культур бактерий. В дальнейшем, Demetriou (WO 00/19817) применял аденозин в количествах от 2,7 до 3,6 мМ. Дополнительно эксперименты авторов показывают, что инозин весьма эффективен в качестве криопротективного агента, и аденозин и инозин являются пуриновыми нуклеотидами. Это наблюдение может быть распространено на монофосфаты. Наши эксперименты показывают, что в качестве криопротективного агента является эффективным ИМФ, но не АТФ. Это еще более удивительно, так как в организме инозиновая кислота (ИМФ) синтезируется из адениловой кислоты (АМФ) гидролитическим дезаминированием (White, 1973). Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления изобретения один или несколько криопротективных агентов выбрано из группы пиримидиновых нуклеотидов и инозина.

В дальнейшем предпочтительном варианте осуществления изобретения один или несколько криопротективных агентов выбрано из группы нуклеозидмонофосфатов. В предпочтительном варианте осуществления, по крайней мере, один или единственный криопротективный агент является ИМФ.

Углеводный или протеиновый типы криопротективных агентов вообще не описаны по поводу увеличения метаболической активности размороженных или восстановленных культур. Криопротективные агенты изобретения в дополнение к их криопротективной активности также могут придавать увеличенную метаболическую активность (бустерный эффект) культуре, когда она инокулируется в питательную среду для ферментации, обработки или преобразования.

Таким образом, один вариант осуществления изобретения - это замороженная или лиофильно-высушенная культура, в которой криопротективный агент является агентом или смесью агентов, который в дополнение к его криопротективному имеет бустерный эффект.

Выражение "бустерный эффект" применяется для описания ситуации, при которой криопротективный агент придает увеличенную метаболическую активность (бустерный эффект) размороженной или восстановленной культуре, когда она инокулируется в питательную среду для ферментации или преобразования. Жизнеспособность и метаболическая активность - не синонимичные понятия. Коммерческие замороженные или лиофильно-высушенные культуры могут сохранять свою жизнеспособность, несмотря на то, что они могут терять значительную долю своей метаболической активности, например, культуры могут потерять свою кислотопродуцирующую (ацидифицирующую) активность при хранении даже в течение укороченных промежутков времени. Таким образом, жизнеспособность и бустерный эффект должны быть оценены различными анализами. Поскольку жизнеспособность оценена анализами жизнеспособности, такими как детерминация колониеобразующих единиц, бустерный эффект оценен количественным определением релевантной метаболической активности размороженной или восстановленной культуры относительно жизнеспособности культуры.

Анализ подкисляющей активности, описанный ниже, является одним примером анализа, количественно определяющего релевантную метаболическую активность размороженной или восстановленной культуры. Бустерный эффект далее проиллюстрирован в Примере 3.

Несмотря на то, что здесь иллюстрируется кислотопродуцирующая активность, это изобретение предназначено, чтобы охватить стабилизацию любых типов метаболической активности культуры. Таким образом, термин "метаболическая активность" относится к активности культуры по удалению кислорода, ее кислотопродуцирующей активности, то есть продукции, например, молочной кислоты, уксусной кислоты, муравьиной кислоты и/или пропионовой кислоты, или ее активности по продукции метаболитов, такой как продукция ароматических соединений, таких как ацетальдегид (α-ацетолактат, ацетоин, диацетил и 2,3-бутиленгликоль (бутандиол)).

В варианте осуществления изобретения замороженная культура содержит или включает от приблизительно 0,2% до приблизительно 20% криопротективного агента или смеси агентов, измеренных в весовом процентном содержании в замороженном материале. Однако предпочтительно добавлять криопротективный агент или смесь агентов в количестве, находящемся в диапазоне от 0,2 до 15%, более предпочтительно в пределах диапазона от 0,2 до 10%, более предпочтительно в пределах диапазона от 0,5 до 7%, и более предпочтительно в пределах диапазона от 1 до 6% по весу, включая в пределах диапазона от 2 до 5% криопротективного агента или смеси агентов, измеренных в весовом процентном содержании в замороженном материале по весу. В предпочтительном варианте осуществления культура включает приблизительно 3% криопротективного агента или смеси агентов, измеренных в весовом процентном содержании в замороженном материале по весу. Предпочтительное количество приблизительно 3% криопротективного агента соответствует концентрациям в диапазоне 100 мМ. Должно быть признано, что для каждого аспекта варианта осуществления изобретения диапазоны могут быть с увеличением описанных диапазонов.

Термин "материал" культуры обозначает релевантные субстанции культуры, включающие и жизнеспособные бактерии, и криопротективный агент. Возможная упаковка не включена. Следовательно, вес материала культуры не включает вес возможной упаковки.

В случае, когда культура является лиофильно-высушенной культурой, предпочтительно добавление криопротективного агента или смеси агентов в количестве, находящемся в диапазоне от 0,8 до 60% по весу, или в пределах диапазона от 0,8 до 55% по весу, или в пределах диапазона от 1,3 до 40% по весу, или в пределах диапазона от 3 до 30% по весу, или в пределах диапазона от 6 до 25% по весу, включая диапазон от 10 до 24% по весу. В предпочтительном варианте осуществления лиофильно-высушенная культура включает приблизительно 16% криопротективного агента или смеси агентов, измеренных в весовом процентном содержании в лиофильно-высушенном материале по весу.

Дополнительно замороженная или лиофильно-высушенная культура может содержать дополнительные традиционные добавки, включая питательные вещества, такие как экстракт дрожжей, сахара, антиоксиданты, инертные газы и витамины и т.д. В качестве дополнительной добавки к культуре согласно изобретению также могут применяться сурфактанты, включая соединения Tween®.

Дополнительные примеры таких традиционных добавок, которые, кроме того, могут быть добавлены к культуре согласно изобретению, могут быть выбраны из протеинов, гидролизатов протеинов и аминокислот. Предпочтительные подходящие примеры их включают выбранные из группы, состоящей из глутаминовой кислоты, лизина, Na-глутамата, Na-казеината, экстракта солода, обезжиренного сухого молока, сухой сыворотки, экстракта дрожжей, глютена, коллагена, желатина, эластина, кератина и альбуминов или их смесей.

Более предпочтительные традиционные добавки - это углеводы. Подходящие их примеры включают выбранные из группы, состоящей из пентоз (например, рибоза, ксилоза), гексоз (например, фруктоза, манноза, сорбоза), дисахаридов (например, сахароза, трегалоза, мелибиоза, лактулоза), олигосахаридов (например, рафиноза), олигофрутозы (например, актилайт, фрибролозы), полисахариды (например, мальтодекстрины, ксантановая смола, пектин, альгинат, микрокристаллическая целлюлоза, декстран, ПЭГ) и сахарные спирты (сорбитол, маннитол и инозитол).

Несмотря на то что существующее изобретение касается любых концентрированных замороженных или лиофильно-высушенных культур, оно в особенности направлено на культуры микроорганизмов, которые участвуют в производстве пищевых и кормовых продуктов, включая большинство молочных продуктов. Предпочтительные варианты осуществления изобретения включают культуры бактерий, в частности культуры бактерий, которые в общем классифицируются как молочнокислые бактерии и которые являются необходимыми в изготовлении всех кисломолочных продуктов, сыра и масла. Культуры таких бактерий часто именуются заквасочными культурами, и они придают специфические особенности различным молочным продуктам, выполняя множество функций. Однако культуры, которые включают культуры грибков, включая культуры дрожжей и культуры филаментных грибков, которые, в частности, применяются в производстве определенных типов сыра и напитка, также именуются заквасочными культурами. Также культуры, которые применяются для обработки других типов пищевых или кормовых продуктов, именуются заквасочными культурами. Культуры, применяемые в производстве силоса, также часто именуются заквасочными культурами.

Согласно изобретению может быть применена заквасочная культура любого организма, который полезен в пищевой или кормовой промышленности, включая молочную промышленность. Таким образом, заквасочная культура может включать один или несколько организмов, выбранных из группы, включающей подвид молочнокислой бактерии (LAB), подвид Bifidobacterium, подвид Brevibacterium, подвид Propionibacterium или подвид грибков, такой как подвид Torula, подвид Penicillium, подвид Cryptococcus, подвид Debraryomyces, подвид Klyveromyces и подвид Saccharomyces. Подходящие культуры из группы молочнокислых бактерий (LAB) включают обычно применяемые штаммы подвида Lactococcus, подвида Streptococcus, подвида Lactobacillus, включая Lactobacillus acidophilus, подвида Enterococcus, подвида Pediococcus, подвида Leuconostoc, подвида Oenococcus, подвида Lactococcus и включают широко применяемый Lactococcus lactis, включая Lactococcus lactis подвид lactis и Lactococcus lactis подвид cremoris, которые обычно применяются в производстве сыров с закрытой текстурой, например чеддер, фета и сыр коттедж.

Следует понимать, что организм заквасочной культуры может быть выбран из генетически модифицированного штамма одного или нескольких вышеупомянутых штаммов молочнокислых бактерий или любых других штаммов заквасочных культур. Используемое здесь выражение "генетически модифицированная бактерия" используется в традиционном значении этого термина, то есть оно относится к штаммам, полученным, подвергая бактериальный штамм любой традиционно применяемой мутагенной обработке, включая обработку химическим мутагеном, таким как этанметан сульфонат (EMS) или N-метил-N'-нитро-N-нитрогуанидин (NTG), УФ облучению или спонтанно возникающим мутациям, включая классический мутагенез. Кроме того, возможно предоставить генетически модифицированную бактерию с помощью неспецифического мутагенеза с последующей селекцией спонтанно возникающих мутантов, то есть без использования ДНК-рекомбинантной технологии. Далее предусмотрено, что мутанты молочнокислых бактерий и других потенциальных полезных организмов заквасочных культур могут быть предоставлены такой технологией, включая сайт-направленный мутагенез и методики ПЦР и другие in vitro или in vivo модификации специфических последовательностей ДНК, как только такие последовательности будут идентифицированы и изолированы. Таким образом, далее рассмотрено, что полезные организмы заквасочных культур могут быть получены при помощи ДНК-рекомбинантной технологии. В частности, привлекательной с точки зрения пищевых стандартов является возможность получать полезные организмы заквасочных культур рекомбинацией последовательностей ДНК, которые были свойственны особому организму, то есть самоклонированием.

Как принято в молочной промышленности, заквасочная культура может включать смесь штаммов, включая смесь штаммов различных видов молочнокислых бактерий, такую как, например, смесь Streptococcus thermophilus и Lactobacillus delbrueckii подвида bulgaricus.

Обычно применяемые штаммы молочной заквасочной культуры в целом разделяются на "мезофильные организмы", которые в настоящем контексте являются организмами, имеющими оптимальные температуры роста приблизительно 30°C, и "термофильные организмы", которые в настоящем контексте являются организмами, имеющими оптимальные температуры роста в диапазоне от приблизительно 40°С до приблизительно 45°C.

Выбор штаммов для заквасочной культуры изобретения будет зависеть от конкретного типа ферментируемого пищевого или кормового продукта, который необходимо произвести. Например, для производства сыра и масла широко применяются мезофильные культуры вида Lactococcus, вида Leuconostoc и вида Lactobacillus. Таким образом, в одном варианте осуществления культура изобретения включает один или несколько мезофильных организмов, имеющих оптимальные температуры роста около 30°C. Типичные организмы, относящиеся к подобным мезофильным организмам, включают Lactococcus lactis, Lactococcus lactis подвид cremoris, Leuconostoc mesenteroides подвид cremoris, Pediococcus pentosaceus, Lactococcus lactis подвид lactis биовар diacetylactis, Lactobacillus casei и Lactobacillus paracasei подвид paracasei.

В еще одном варианте осуществления изобретения культура изобретения включает один или несколько термофильны