Способ пивоварения

Способ пивоварения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Ссылка на список последовательностей

Эта заявка содержит список последовательностей в машиночитаемой форме. Содержание машиночитаемой формы приведено в настоящем документе в качестве ссылки.

Область изобретения

Изобретение относится к способу получения пивного сусла, включающему ферментативную обработку крупки, содержащей до 100% несоложеной (зерновой) формы, а также относится к суслу, получаемому этим способом.

Изобретение также касается применения указанного сусла для дальнейшей переработки в высококачественные напитки и относится к способу получения высококачественного пива или пивного продукта, а также к высококачественному пиву, полученному согласно этому способу. Изобретение также относится к ферментным смесям.

Уровень техники

Затирание представляет собой способ превращения крахмала из размолотого ячменного солода и добавок в ферментируемые и неферментируемые сахара для получения сусла желательного состава. Общепринятое затирание включает смешивание размолотого ячменного солода и добавок с водой при установленных температуре и объеме для продолжения биохимических изменений, начатых во время процесса соложения. Процесс затирания проводят в течение периода времени при различных температурах, чтобы активировать эндогенные ферменты, ответственные за деградацию белков и углеводов. После процесса затирания затор фильтруют для получения сусла для ферментации до пива. Традиционно пиво варят из соложеного ячменя, хмеля, дрожжей и воды. Соложение злаков, таких как ячмень, активирует эндогенные ферменты, необходимые для деградации крахмала. Однако процесс соложения требует много энергии и времени и, таким образом, является достаточно дорогостоящим. Таким образом, одним способом является замена части солода легко доступными добавками, такими как рафинированный крахмал или легко ферментируемые углеводы, и/или заменой несоложеными злаками, такими как ячмень, кукуруза, рис, сорго и пшеница. Однако в несоложеных злаках отсутствуют эндогенные ферменты, что может приводить к неполному осахариванию, увеличенной вязкости затора/сусла, трудностям с процеживанием, плохой способности к ферментации, трудностям с фильтрацией пива, коллоидальной неустойчивости и плохому вкусу. Экзогенные ферменты, такие как альфа-амилаза и β-глюканаза, ранее добавляли для компенсации отсутствующих ферментов солода. В следующих публикациях по уровню техники описана замена части соложеных злаков несоложеными злаками и экзогенно добавленными ферментами.

В ZA 9803237 описан способ получения пива посредством ферментации сусла, полученного из частично несоложеного ячменя и ферментной смеси из альфа-амилазы, β-глюканазы и протеазы. В Wieg et.al. Process Biochemistry, 1970, описан также способ пивоварения со смесью соложеного и несоложеного ячменя и ферментной смесью из альфа-амилазы, β-глюканазы и протеазы. Кроме того, в WO04/011591 описан способ получения сусла добавлением протеазы и целлюлазы к затору из соложеного и несоложеного ячменя. Описание пивоварения из ячменя приведено в Wieg et.al. Brewing science, 1987.

Другой способ получения сусла известен из производства японского пива Хаппошу. В Японии налоги на содержащие солод спиртные напитки являются относительно высокими, и поэтому вид пива Хаппошу варят всего лишь с 25% соложеного ячменя. Обычно затор, полученный с настолько малым содержанием солода, является невозможным фильтровать для получения сусла, так как затор слишком густой для фильтрования. Существует только немного доступных технических описаний относительно состава затора Хаппошу. Однако известно, что необходимо добавлять экзогенные ферменты к затору, чтобы получить способность к фильтрованию, например протеазы, β-глюканазы и амилазы. Виды пива Хаппошу обладают отличающимися вкусовыми характеристиками, даже по сравнению с традиционными видами пива более простого лагерного типа. В JP 2004173533 описано получение такого пива с использованием прессованного ячменя и меньшего количества солода. Различные ферменты используют для облегчения, например осахаривания.

Виды сусла, полученные в ссылках на уровень техники, основаны на крупке, содержащей значительное количество солода. Состав ферментов в необработанных злаках по существу отличается от соложеных злаков, и эндогенные, и экзогенные ферменты, вовлеченные в деградацию крахмала, действуют совместно комплексным образом во время затирания, и, как правило, принимают, что некоторое количество солода должно присутствовать в крупке. Таким образом, даже с экзогенно добавленными ферментами еще существуют некоторые из вышеупомянутых проблем, например со способностью к фильтрованию, способностью к ферментации и мутностью видов сусла на основе несоложеных злаков. Следовательно, предпринимали очень мало попыток заменить большее количество или все соложеные злаки несоложеными злаками.

Одним примером является Goode et.al., где описано получение сусла из субстрата 100% сырьевого ячменя и ферментной смеси из двух различных альфа-амилаз и бета-глюканазы. Альфа-амилаза оказывает положительный эффект на разделение затора, но скорость фильтрации падает, когда присутствуют большие количества несоложеного ячменя. В US 3081172 также предложено получение сусла из несоложеного сырьевого материала, однако ничего не указано относительно FAN (свободного аминного азота), количества ферментируемых сахаров и других критических параметров полученного сусла.

Следовательно, такие проблемы, как низкая способность к ферментации, неоптимальный аминокислотный состав и высокая вязкость и мутность сусла, не разрешены, и эти препятствия проявляют тенденцию увеличиваться с увеличением количеств несоложеных злаков.

Другими недостатками пивоварения на уровне техники с несоложеными злаками является то, что может потребоваться продолжительное время затирания, чтобы экзогенные и эндогенные ферменты в заторе образовывали сусло, сравнимое, например, по отношению к способности к ферментации, с суслом, полученным из соложеных злаков. Продолжительное время затирания явно является неэкономичным и может нейтрализовать экономические преимущества замены соложеных злаков на несоложеные.

Таким образом, до настоящего времени ни одна ферментная смесь не компенсирует полностью ферменты солода, так чтобы при ее добавлении крупку, основанную на соложеных злаках, можно было полностью заменить на до 100% несоложеные злаки.

Таким образом, даже несмотря на то, что попытки получения сусла из ячменя предпринимали с поздних 1960, не разработано ни одного эффективного способа варки пива на основе сырьевого материала с большим количеством несоложеных злаков.

С учетом желания снизить расходы, связанные с соложением злаков, а также получить сусло, пригодное для производства пива, сравнимого по вкусовым характеристикам с традиционными видами пива, существует потребность в создании способа получения затора на основе, вплоть до 100%, несоложеных злаков. Способ должен являться легко адаптируемым к системам пивоварения, используемым в пивоварении, основанном на соложеном сырьевом материале. Таким образом, затор должен поддаваться фильтрации и, кроме того, другие параметры, такие как аминокислотный состав и количество ферментируемых сахаров, должно являться сравнимым с затором на основе соответствующих соложеных злаков, даже если злак(и) представляет/представляют собой 100% несоложеные злак(и). Наконец, время затирания должно являться сравнимым со временем затирания соложеного сырьевого материала, в то время как еще сохраняются хорошие характеристики, например состав сахаров затора и пивного продукта.

Таким образом, целью изобретения является разработка способа получения сусла из крупки, содержащей более 70%, и даже до 100% несоложеных злаков.

Существо изобретения

Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что добавлением подходящей смеси экзогенных ферментов к затору и термической активацией/инактивацией эндогенных ферментов в настоящее время можно получать сусло на основе до 100% несоложеных злаков, таких как ячмень.

Способ получения пивного сусла, включающий:

a. получение затора затиранием крупки, из которой по меньшей мере 70 вес.% представляет собой несоложеный злак(и), содержащий β-амилазную активность, и из которой менее 30 вес.% представляет собой соложеный злак(и), при температуре, при которой экзогенные (добавленные) ферменты и эндогенная β-амилаза являются активными;

b. контактирование затора с экзогенными ферментами, содержащими:

i. α-амилазную активность,

ii. пуллуланазную активность,

iii. протеолитическую активность, и

iv. β-глюканазную активность;

c. отзаторивание и фильтрование затора для получения сусла.

В предпочтительном варианте выполнения несоложеный злак(и) происходят из трибы Triticeae, например ячмень, спельта, пшеница, рожь.

В другом варианте выполнения несоложеный злак(злаки) может быть любым несоложеным злаком, в качестве неограничивающего примера, таким как ячмень, спельта, пшеница, рожь, кукуруза, овес или рис или любая их смесь. В варианте выполнения крупка может содержать смесь несоложеных злаков, в качестве неограничивающих примеров, такую как смесь несоложеного ячменя и несоложеной пшеницы, смесь несоложеного риса и несоложеного ячменя.

В одном варианте выполнения изобретение относится к способу, в котором крупка дополнительно содержит другие источники углевода, такие как пивные сиропы или любую их смесь.

В другом варианте выполнения экзогенные ферменты со стадии b. дополнительно содержат ксиланазную активность, липазную активность и/или фитазную активность.

В предпочтительном варианте выполнения температура затирания находится в диапазоне, оптимизирующем β-амилазную активность и уменьшающем липоксигеназную активность.

Предпочтительный вариант выполнения изобретения относится к способу, где пуллуланаза является термостабильной, обладающей относительной ферментативной активностью более 60% в течение периода 30 мин, при 65°C и при уровне pH 5.

В следующем аспекте изобретение относится к суслу, полученному способом по изобретению. Кроме того, изобретение относится к применению сусла для получения видов пива любого типа, например светлого и темного лагерных типов, светлого и темного типов эля, видов пшеничного пива, всех видов портера, стаута, концентрированных замораживанием (например, айсбок), типов ячменного вина или хаппошу.

В следующем аспекте сусло по изобретению содержит одну или несколько аминокислот, выбранных из

a. пролина в концентрации менее 2 мМ, предпочтительно менее 1 мМ и наиболее предпочтительно менее 0,5 мМ в сусле;

b. серина в концентрации более 0,1 мМ, предпочтительно более 0,125 мМ и наиболее предпочтительно более 0,15 мМ; и

c. метионина в концентрации более 0,05 мМ, предпочтительно более 0,08 мМ и наиболее предпочтительно более 0,10 мМ.

Изобретение также относится к ферментной смеси, содержащей:

i. α-амилазную активность,

ii. пуллуланазную активность, где пуллуланаза является термостабильной,

iii. протеолитическую активность и

iv. β-глюканазную активность.

Конкретный вариант ферментной смеси содержит:

i. α-амилазную активность,

ii. пуллуланазную активность,

iii. протеолитическую активность,

iv. β-глюканазную активность и

v. ксиланазную активность.

В другом варианте ферментная смесь дополнительно содержит липазную активность.

Фигуры:

На фиг.1 показана мутность (NTU) сусла, полученного из увеличивающегося количества ячменя при экзогенном добавлении только Ultraflo Max.

На фиг.2 показана способность к ферментации сусла, полученного из 100% несоложеного ячменя или 100% соложеного ячменя.

Определения:

В данном описании использованы различные термины, обычно понятные специалистам в данной области. Однако некоторые термины используются со специфическими значениями, и они означают следующее, как определено ниже.

Термин «соложение» представляет собой процесс, посредством которого зерна заставляют прорастать и затем высушивают.

Термин «соложеное зерно» означает любое зерно злаков, в частности ячменя, которое подвергали процессу соложения.

Термин «несоложеное зерно» означает любое зерно злаков, в частности ячменя, которое не подвергали процессу соложения.

Термин «крупка» означает крахмалосодержащий или сахаросодержащий материал, который является основой для получения пива. Он может содержать соложеные и несоложеные злаки, а также добавки.

Термин «злаки» означает виды зерна, которые представляют собой любой крахмалосодержащий материал, используемый в качестве сырьевого материала, например, для получения пива, такие как, в качестве неограничивающих примеров, ячмень, пшеница, сорго, маис, рис, овес и рожь. Злаки могут быть соложеными или несоложеными.

Термин «добавки» означают сырьевой материал, который добавляют к главному ингредиенту крупки, который традиционно представляет собой соложеные злаки. Таким образом, поскольку виды несоложеного зерна обычно составляют только малую часть крупки, несоложеные злаки обычно определяют как добавку вместе с жидкими углеводами, такими как сахара и сиропы. Добавки могут являться либо твердыми, либо жидкими, либо и такими, и другими, где твердая часть может представлять собой несоложеные злаки, такие как ячмень, кукуруза и рис, в то время как жидкая часть может представлять собой легко ферментируемые углеводы, такие как сахар и сиропы.

Однако в этом контексте то, что можно рассматривать как добавку, может представлять собой главный ингредиент. Таким образом, несоложеные злаки, которые в традиционном контексте представляют собой добавку, могут в соответствии с настоящим изобретением составлять 100% сырьевого материала.

Соответственно несоложеные злаки обычно включены в термин добавка, однако, поскольку несоложеные злаки предпочтительно составляют более 70% сырьевого материала, а соложеные злаки предпочтительно составляют менее 30% сырьевого материала, термины в этом контексте наиболее просто понимать как:

Крупка может содержать соложеные и несоложеные злаки и добавки. Добавки в этом контексте понимают как часть крупки, которая представляет собой несоложеный или несоложеный злак. Таким образом, добавки в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно представляют собой жидкую часть, такую как пивоваренные сиропы и сахара.

В то время как несоложеные злаки представляют собой любой несоложеный злак, содержащий зерновой крахмал, такой как, в качестве неограничивающих примеров, ячмень, кукуруза, рис, рожь, виды овса, сорго и пшеница. Соответственно крупка из 100% несоложеного зерна может содержать несоложеный ячмень и другие, не относящиеся к ячменю несоложеные злаки, такие как рис и пшеница.

В другом варианте выполнения изобретения крупка содержит смесь несоложеных злаков, такую как, в качестве неограничивающих примеров, смесь несоложеного ячменя и несоложеной пшеницы, смесь несоложеного риса и несоложеного ячменя. Таким образом, крупка может содержать 50% несоложеного ячменя и 50% несоложеных других злаков, таких как пшеница и рис.

В особенно предпочтительном варианте выполнения изобретения несоложеный злак(и) составляет более 70% крупки, и соложеные злаки составляют менее 30% крупки.

Термин «затор» понимают как содержащую крахмал суспензию, содержащую измельченный ячменный солод, другой содержащий крахмал материал или их комбинации, погружаемые в воду для получения сусла.

Термин «процесс затирания» или профиль затирания, или просто затирание понимают как процесс объединения зерна с водой и нагревания смеси с перерывами при конкретных температурах, чтобы позволить ферментам в заторе расщепление крахмала в зерне на сахара для получения сусла.

«Отзаторивание» или отделение затора происходит, когда температура затора поднимается. Это высвобождает до приблизительно на 2% больше крахмала и делает затор менее вязким.

Термин «сусло» понимают как неферментированный жидкий слив после экстракции крупки во время затирания. Термины “сусло для пивоварения” и “сусло” используют взаимозаменяемо на протяжении заявки.

Термин «пивная дробина» понимают как высушенные твердые вещества, оставшиеся после экстракции крупки и отделения сусла.

Термин «пиво» в настоящем документе понимают как ферментированное сусло.

Термин «пивной продукт» в настоящем документе понимают как включающий «затор», «сусло», «пивную дробину» и «пиво».

Термин «DP1» обозначает глюкозу.

Термин «DP2» обозначает мальтозу.

Термин «DP3» обозначает мальтотриозу.

Термины «DP4+» или «DP4/4+» обозначают декстрин, или мальтоолигосахариды степени полимеризации 4 или выше.

Термин «Fru» обозначает фруктозу.

Термин «RDF» обозначает истинную степень ферментации.

Термин «FAN» обозначает свободный аминный азот.

Термин «Плато» (°P) обозначает грамм экстракта на 100 г сусла (грамм экстракта/100 г сусла).

Подробное описание изобретения

Посредством добавления комбинации экзогенных ферментов, например α-амилазы, изоамилазы/пуллуланазы, с активностью образования FAN (протеазы) и с активностью усиления способности к фильтрации (бета-глюканазы и/или ксиланазы), к затору и посредством одновременной термической активации образующей мальтозу эндогенной β-амилазы можно получать сусло на основе до 100% несоложеного злака(злаков).

Таким образом, в первом аспекте изобретение относится к способу получения пивного сусла, включающему:

a. получение затора затиранием крупки, из которой по меньшей мере 70 вес.% представляет собой несоложеный злак(и), содержащий β-амилазную активность, и из которой менее 30 вес.% представляет собой соложеный злак(и), при температуре, при которой экзогенные (добавленные) ферменты и эндогенная β-амилаза являются активными;

b. контактирование затора с экзогенными ферментами, содержащими:

i. α-амилазную активность,

ii. пуллуланазную активность,

iii. протеолитическую активность и

iv. β-глюканазную активность;

c. отзаторивание и фильтрация затора для получения сусла.

В предпочтительном аспекте изобретение относится к способу, где крупка содержит по меньшей мере 70 вес.% несоложеного злак(а), например, по меньшей мере 75 вес.%, более предпочтительно по меньшей мере 80 вес.%, более предпочтительно по меньшей мере 85 вес.%, более предпочтительно по меньшей мере 86 вес.%, более предпочтительно по меньшей мере 87 вес.%, более предпочтительно по меньшей мере 88 вес.%, более предпочтительно по меньшей мере 89 вес.%, более предпочтительно по меньшей мере 90 вес.%, более предпочтительно по меньшей мере 91 вес.%, более предпочтительно по меньшей мере 92 вес.%, более предпочтительно по меньшей мере 93 вес.%, более предпочтительно по меньшей мере 94 вес.%, более предпочтительно по меньшей мере 95 вес.%, более предпочтительно по меньшей мере 96 вес.%, более предпочтительно по меньшей мере 97 вес.%, более предпочтительно по меньшей мере 98 вес.%, еще предпочтительнее 99 вес.% и наиболее предпочтительно 100 вес.% несоложеного злака(злаков).

Следует понимать, что по меньшей мере 70 вес.% несоложеного злака(злаков) может представлять собой один или несколько злак(злаков), где по меньшей мере один из злака(злаков) содержит β-амилазную активность.

В одном аспекте изобретения крупка содержит менее 30 вес.% соложеных злаков, более предпочтительно менее 25 вес.%, более предпочтительно менее 20 вес.%, более предпочтительно менее 15 вес.%, более предпочтительно менее 10 вес.%, более предпочтительно менее 5 вес.% и еще предпочтительнее менее 3 вес.%, и наиболее предпочтительно крупка содержит 0 вес.% соложеных злаков.

В предпочтительном варианте выполнения несоложеный злак(и) происходят из трибы Triticeae. Предпочтительными среди этой трибы являются ячмень, спельта, пшеница и рожь. Triticeae представляет собой трибу внутри подсемейства злаковых Pooideae, которое включает роды со многими одомашненными видами, EA Kellogg, R Appels, RJ Mason-Gamer - SYSTEMATIC BOTANY, 1996. Роды основных культур обнаружены в этой трибе, включая пшеницу, ячмень и рожь. В другом предпочтительном варианте выполнения крупка содержит несоложеные злаки, отличные от злаков из трибы Triticeae, такие как, в качестве неограничивающих примеров, рис, кукуруза, овес, сорго.

В другом предпочтительном варианте выполнения несоложеные злак(и) выбраны из группы, содержащей ячмень, спельту, пшеницу, рожь, кукурузу, овес или рис, или любую их смесь.

Таким образом в одном варианте выполнения изобретение относится к способу, где крупка дополнительно содержит один или несколько несоложеный злак(ов), таких как кукурузная крупка, кукурузный крахмал и рис. Крупка, таким образом, может содержать смесь несоложеных злаков, такую как, в качестве неограничивающих примеров, смесь несоложеного ячменя и несоложеной пшеницы или смесь несоложеного риса и несоложеного ячменя.

В особенно предпочтительном варианте выполнения изобретения несоложеный злак представляет собой ячмень.

В другом аспекте крупка дополнительно содержит 0-50 вес.% других источников углевода, таких как сиропы для пивоварения или любые их смеси.

В другом варианте выполнения экзогенные ферменты со стадии b., указанной выше, дополнительно содержат ксиланазную активность, предпочтительно семейства GH10 (гликозил-гидролаза семейства 10), которая может улучшать фильтрование сусла и пива.

В другом варианте выполнения экзогенные ферменты со стадии b., указанной выше, дополнительно содержат липазную активность, которая может улучшать фильтрование сусла и уменьшать мутность.

В другом варианте выполнения экзогенные ферменты со стадии b., указанной выше, дополнительно содержат фитазную активность.

В другом варианте выполнения экзогенные ферменты со стадии b., указанной выше, дополнительно содержат одну или несколько из следующих видов активности; ксиланазная активность, липазная активность и/или фитазная активность.

В предпочтительном варианте выполнения температура затирания, т.е. температура, при которой экзогенные (добавленные) ферменты и эндогенная β-амилаза являются активными, находится в диапазоне, оптимизирующем активность каждого из различных ферментов на каждой стадии нагревания. Процесс затирания предпочтительно проводят в три стадии, где каждая оптимизирована для различных ферментов. Эти стадии можно обозначать как выдержки с ферментами или ферментативные стадии.

Таким образом, определенный вариант выполнения изобретения относится к температурному профилю процесса затирания для получения сусла для пивоварения, где

Первую стадию проводят между 50 и 58°C,

Вторую стадию проводят между 60 и 65°C, и

Третью стадию проводят между 70 и 80°C.

Различные ферменты в процессе затирания, как экзогенные, так и эндогенные, имеют различный температурный оптимум, и процесс затирания можно проводить при различных температурах в течение конкретного периода времени, чтобы позволить ферментам прореагировать. Эти периоды часто обозначают как выдержки с ферментами.

На первой стадии, которую можно назвать протеолитической стадией, температура предпочтительно находится в диапазоне оптимизации, например, для протеолитического фермента, температура предпочтительно составляет между 45°C и 58°C, например предпочтительно между 46°C и 57°C, например предпочтительно между 47°C и 56°C, например предпочтительно между 48°C и 55°C, например предпочтительно между 49°C и 54°C, например предпочтительно между 50°C и 54°C, например предпочтительно между 51°C и 54°C, например предпочтительно между 52°C и 54°C, наиболее предпочтительно между 53°C и 54°C, например 54°C.

На второй стадии температура предпочтительно находится в диапазоне оптимизации, например, для превращающих крахмал ферментов, таких как β-амилаза и пуллуланаза. Эту стадию часто обозначают как стадию осахаривания, и температура предпочтительно составляет между 60°C и 72°C, например предпочтительно между 60°C и 70°C, например предпочтительно между 62°C и 68°C, например предпочтительно между 63°C и 67°C, например предпочтительно между 64°C и 66°C и наиболее предпочтительно между 64°C и 65°C, например 64°C.

На третьей стадии, которую можно также обозначать, как отзаторивание или отделение затора, высвобождается до около 2% более крахмала, что делает затор менее вязким, позволяя процеживанию протекать быстрее. Температура отделения затора составляет предпочтительно между 72°C и 82°C, например предпочтительно между 73°C и 81°C, например предпочтительно между 74°C и 80°C, например предпочтительно между 75°C и 79°C, например предпочтительно между 76°C и 78°C, наиболее предпочтительно температура составляет между 78-80°C, например 80°C.

Известно, что эндогенная липоксигеназа является источником неприятного привкуса, и в предпочтительном варианте выполнения температура затирания на первой стадии затирания, указанной выше, находится в диапазоне, уменьшающем активность липоксигеназы по меньшей мере на 50%, предпочтительно на 55%, предпочтительно на 60%, предпочтительно на 65%, предпочтительно на 70%, предпочтительно на 75%, предпочтительно на 80%, предпочтительно на 85%, наиболее предпочтительно на 90% относительно активности при затирании при 54°C.

Кроме того, изобретение относится к ферментной смеси, содержащей:

i. α-амилазную активность,

ii. пуллуланазную активность, где пуллуланаза является термостабильной,

iii. протеолитическую активность и

iv. β-глюканазную активность;

или в другом варианте выполнения изобретение относится к ферментной смеси, содержащей:

v. α-амилазную активность,

vi. пуллуланазную активность,

vii. протеолитическую активность,

viii. β-глюканазную активность и

ix. ксиланазную активность.

Ферментные смеси могут дополнительно содержать липазную активность.

Термины “ферментная смесь” и “смесь ферментов” используются взаимозаменяемо в тексте описания настоящей заявки. Эти термины следует понимать как смесь или комбинацию различных ферментов или видов ферментативной активности. Ферменты можно добавлять в такую смесь или комбинацию по отдельности или одновременно. Ферменты, если их не добавляют вместе, можно добавлять в любом порядке, и не обязательно добавлять их в порядке, перечисленном выше.

Ферменты по изобретению можно добавлять в любое время при затирании или перед затиранием. Таким образом, ферменты можно добавлять к ингредиентам затора, например к воде и/или крупке до, во время или после формирования затора. Ферменты можно добавлять вместе или по отдельности.

В предпочтительном аспекте α-амилазная активность обеспечивается α-амилазой, происходящей из грибов, например из Aspergillus niger, или происходящей из бактерий, например Bacillus. Таким образом, α-амилаза может представлять собой вариант бактериальной α-амилазы, обладающий увеличенной термостабильностью при кислом pH и/или низкой концентрации Ca²⁺. Предпочтительно, α-амилазная активность в заторе составляет 0,1-1,0 KNU(S)/г, более предпочтительно 0,2-0,4 KNU(S)/г и наиболее предпочтительно 0,25-0,35 KNU(S)/г сухой массы злака(злаков). Предпочтительно α-амилаза обладает по меньшей мере 50%, более предпочтительно по меньшей мере 60%, более предпочтительно по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, предпочтительно по меньшей мере 91%, предпочтительно по меньшей мере 92%, предпочтительно по меньшей мере 93%, предпочтительно по меньшей мере 94%, более предпочтительно по меньшей мере 95%, предпочтительно по меньшей мере 96%, предпочтительно по меньшей мере 97%, более предпочтительно по меньшей мере 98% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 99% идентичностью с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1 (вариант α-амилазы B. stearothermophilus с мутациями I181^* G182^* N193F, описанный в WO99/19467 и доступный как Termamyl® SC из Novozymes A/S).

В предпочтительном варианте выполнения изобретения деветвящую крахмал активность обеспечивает пуллуланаза. В другом варианте выполнения изобретения деветвящую активность обеспечивают другие деветвящие ферменты, такие как, в качестве неограничивающих примеров, изоамилаза или предельная декстриназа. В конкретном варианте выполнения изобретения деветвящую активность обеспечивает смесь деветвящих ферментов, таких как, в качестве неограничивающих примеров, пуллуланаза и изоамилаза.

Таким образом, в предпочтительном варианте выполнения изобретения ферментативная пуллуланазная активность (E.C. 3.2.1.41) обеспечивается экзогенно, и она присутствует в заторе. Пуллуланазу можно добавлять к ингредиентам затора, например к воде и/или крупке, до, во время или после формирования затора.

Пуллуланазы в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно представляют собой пуллуланазу, например, из Pyrococcus или Bacillus, такого как Bacillus acidopullulyticus, например, описанную в FEMS Microbiol. Letters 115: 97-106, или пуллуланазу, доступную из Novozymes как Промозим 400L и имеющую последовательность SEQ ID NO:2. Пуллуланаза может происходить также из Bacillus naganoencis или Bacillus deramificans, например, такая как получена из Bacillus deramificans (патент США 5736375), и иметь последовательность SEQ ID NO:7. Пуллуланазы могут также представлять собой модифицированные пуллуланазы, например, из штамма Bacillus.

Другие пуллуланазы можно получать из Pyrococcus woesei, описанного в PCT/DK91/00219, или пуллуланазу можно получать из Fervidobacterium sp. Ven 5, описанного в PCT/DK92/00079, или пуллуланазу можно получать из Thermococcus celer, описанного в PCT/DK95/00097, или пуллуланазу можно получать из Pyrodictium abyssei, описанного в PCT/DK95/00211, или пуллуланазу можно получать из Fervidobacterium pennavorans, описанного в PCT/DK95/00095, или пуллуланазу можно получать из Desulforococcus mucosus, описанного в PCT/DK95/00098.

Наиболее предпочтительно пуллуланаза получена из Bacillus acidopullulyticus. Предпочтительный фермент пуллуланаза для применения в способах и/или композициях по изобретению представляет собой пуллуланазу, обладающую аминокислотной последовательностью, которая по меньшей мере на 50%, например по меньшей мере на 55%, например по меньшей мере на 60%, например по меньшей мере на 65%, например по меньшей мере на 66%, например по меньшей мере на 70%, например по меньшей мере на 75%, например по меньшей мере на 80%, например по меньшей мере на 85%, например по меньшей мере на 86%, например по меньшей мере на 87%, например по меньшей мере на 88%, например по меньшей мере на 89%, например по меньшей мере на 90%, например по меньшей мере на 91%, например по меньшей мере на 92%, например по меньшей мере на 93%, например по меньшей мере на 94%, например по меньшей мере на 95%, например по меньшей мере на 96%, например по меньшей мере на 97%, например по меньшей мере на 98%, например по меньшей мере на 99% или даже на 100% идентична последовательности SEQ ID NO:8 (NS26062, PulC, из Bacillus acidopullulyticus); в частности, при выравнивании с использованием программного обеспечения Needle с использованием матрицы: BLOSUM62; штраф за открытие делеции 10,0; штраф за расширение делеции 0,5; матрицы идентичности без делеций. Термины PulC, NS26062 и пуллуланаза C используют взаимозаменяемо на протяжении заявки.

Пуллуланазу добавляют в дозе 0,1-3 PUN/г сухого вещества, например 0,2-2,9, например 0,3-2,8, например 0,3-2,7, например 0,3-2,6, например 0,3-2,5, например 0,3-2,4, например 0,3-2,3, например 0,3-2,2, например 0,3-2,1, например 0,3-2,0, например 0,3-1,9, например 0,3-1,8, например 0,3-1,7, например 0,3-1,6, наиболее предпочтительно пуллуланазу добавляют в дозе, например, 0,3-1,5, предпочтительно 0,4-1,4, более предпочтительно 0,5-1,3, более предпочтительно 0,6-1,2, более предпочтительно 0,7-1,1, более предпочтительно 0,8-1,0, более предпочтительно 0,9-1,0. В конкретном варианте выполнения изобретения добавляют 0,3 PUN/г сухого вещества фермента, например 0,4 PUN/г сухого вещества, например 0,5 PUN/г сухого вещества; в особенно предпочтительном варианте выполнения изобретения доза ферментов не превышает 1 PUN/г сухого вещества. Предпочтительно изоамилазная или/и пуллуланазная активность в заторе составляет 0,1-2,0 PUN/г, более предпочтительно 0,5-1,0 PUN/г сухой массы злака(злаков).

Относительная деветвящая ферментативная активность, такая как пуллуланазная активность, может значительно меняться при различных температурах, например, как показано в примере 2 заявки. Деветвящие ферменты действуют вместе с другими ферментами в заторе, в частности β-амилазой, которая обычно является эндогенной, и α-амилазой, которая может являться эндогенной или экзогенно добавленной. Таким образом, предпочтительный деветвящий фермент по изобретению представляет собой фермент, обладающий высокой относительной ферментативной активностью в диапазоне температур, в котором как β-амилаза, так и α-амилаза являются активными. α-Амилаза обычно является активной при более высокой температуре, чем β-амилаза, и стадию осахаривания процесса затирания, стадию, где крахмал превращают в ферментируемые сахара посредством α-амилазы, β-амилазы и деветвящего фермента, предпочтительно проводят при высокой температуре, такой как по меньшей мере 63°С. Таким образом, деветвящий фермент по изобретению предпочтительно является термостабильным и термоактивным. Термины “термостабильный” и “термоактивный” используют взаимозаменяемо на протяжении заявки.

В этом контексте термостабильный фермент представляет собой фермент, обладающий относительной ферментативной активностью выше 60%, измеренной в течение периода 30 мин, при 65°C и при уровне pH 5.

Относительную активность, которая в этом контексте представляет собой относительную ферментативную активность, рассчитывают, устанавливая наивысшую активность на 100% (максимум) и устанавливая активности при других температурах относительно температурного максимума.

Таким образом, предпочтительно деветвящий фермент представляет собой пуллуланазу, и еще предпочтительнее пуллуланазная активность обеспечивается пуллуланазой, которая является термостабильной и обладает относительной ферментативной активностью более 60% в течение периода 30 мин, при 65°C и при уровне pH 5. Пример термостабильной пуллуланазы приведен в примере 2.

В одном варианте выполнения относительная ферментативная пуллуланазная активность составляет более 60%, например более 61%, например более 62%, например более 63%, например более 64%, например более 65%, например более 66%, например более 67%, например более 68%, например более 69%, например более 70%, например более 71%, например более 72%, например более 73%, например более 74%, например более 75%, например более 76%, например более 77%, например более 78%, например более 79%, например более 80%, например более 81%, например более 82%, например более 83%, например более 84%, например более 85%, например более 86%, например более 87%, например более 88%, например более 89%, например более 90%, например более 91%, например более 92%, например более 93%, например более 94%, например более 95%, например более 96%, например более 97%, например более 98%, например более 99% и даже 100% при 65°C, при измерении в течение периода 30 минут, при pH 5,0.

В особенно предпочтительном варианте выполнения изобретения термостабильная пуллуланаза обладает относительной ферментативной активностью более 80% в течение периода 30 мин, при 65°C и при уровне pH 5.

В конкретном варианте выполнения пуллуланаза обладает более 80%, например более 85%, например более 90%, например более 95%, или даже 100% остаточной ферментативной активности в течение периода 30 мин при условиях затирания с 12 °P ячменя, при температуре желатинизации несоложеного ячменя и при pH в диапазоне 5,6-6,2, по сравнению с активностью до инкубации при температуре желатинизации несоложеного ячменя.

В другом варианте выполнения протеазная активность обеспечивается системой протеолитических ферментов, обладающих подходящей FAN-генерирующей активностью, включая эндопротеазы, экзопептидазы или любую их комбинацию, предпочтительно металлопротеазу. Предпочтительно протеазная активность в заторе составляет 0,0005-0,002 AU/г, более предпочтительно 0,001-0,0015 AU/г сухой массы злака(злаков). Предпочтительно протеаза обладает по меньшей мере 50%, более предпочтительно по меньшей мере 60%, более предпочтительно по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 91%, более предпочтительно по меньшей мере 92%, более предпочтительно по ме