Способ предотвращения или уменьшения реакции майяра в пищевом продукте, применение фермента для этого и пищевой продукт, полученный этим способом

Способ предотвращения или уменьшения реакции майяра в пищевом продукте, применение фермента для этого и пищевой продукт, полученный этим способом

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Данное изобретение относится к контролю реакции Майяра в пищевых продуктах.

Пищевые продукты содержат ингредиенты чрезвычайно широкого спектра. Эти ингредиенты включают

- азотсодержащие (белковые) соединения (например, одна или несколько свободных аминокислот или их производных, гидролизаты белка, интактные целые белки или их смеси) в сочетании с витаминами, включая витамины, содержащие аминный азот и их производные, и другими соединениями, содержащими неаминный азот, например аммониевыми соединениями, такими как сульфат аммония;

- углеводы, включая

- редуцирующие (восстанавливающие) сахара, такие как глюкоза (известная также, как декстроза), фруктоза (известная также, как левулеза), сахара, содержащие 5 атомов углерода, или пентозные сахара, такие как ксилоза, и другие соединения, содержащие альдегидные группы, которые могут быть найдены, например, в ароматизаторах;

- нередуцирующие (невосстанавливающие) дисахариды (например, сахарозу), которые могут гидролизоваться с получением восстанавливающей сахарной группы, причем эта реакция ускоряется в присутствии влаги и при повышенных температурах.

Со временем, в присутствии влаги реакция Майяра происходит даже при умеренной температуре (например, при температурах выше температуры замерзания воды).

Реакция Майяра представляет собой реакцию, включающую нуклеофильную атаку свободной аминогруппы, присутствующей в белке, пептиде или аминокислоте, на альдегидную группу редуцирующего сахара. Продукты этой реакции вызывают ряд последующих реакций с другими белковыми аминогруппами, в результате чего образуется коричневое вещество и происходит сшивание белков. В 1912 году Майяром было сделано сообщение о том, что смешанный раствор аминокислоты и редуцирующего сахара при нагревании окрашивается в коричневый цвет (L. Maillard, Compt. Rend. Soc. Biol., 72, 599 (1912)), и с тех пор эту реакцию называют реакцией Майяра. В пищевых продуктах реакция Майяра обычно включает взаимодействие азотсодержащих соединений с альдегидными группами редуцирующих сахаров или других соединений, содержащих карбонильную группу.

В одних случаях коричневое окрашивание по реакции Майяра является желательным, например, в ирисе, карамели, в мясных изделиях, прошедших тепловую обработку, и т.д. В других случаях эта реакция нежелательна. Например, реакция Майяра может быть нежелательной в некоторых хлебопекарных изделиях типа «гратин» (например, пицце) или пирожных, в которых такая реакция коричневого окрашивания плохо поддается контролю. Это может приводить к тому, что привлекательный коричневый цвет становится слишком темным и появляются черные пузыри. Это, разумеется, нежелательно.

Кроме того, реакция Майяра может быть нежелательной при получении пищевых продуктов, содержащих молочный продукт, и в частности, сыра, который проходит тепловую обработку при высокой температуре. При приготовлении пиццы реакция Майяра протекает в сыре, распределенном на поверхности пиццы. В данном описании и на практике - в случае изделий типа «pasta fileta» - используют сыр моццарелла.

Многие производители пиццы выпекают ее при температурах выше 260°С. Способность сыра приобретать слишком темную коричневую окраску при таких высоких температурах стала предметом особого внимания при производстве пиццы, так как производители моццареллы должны изготавливать такой сыр, в котором в процессе выпекания при высоких температурах не будут образовываться черные пузыри и коричневые пятна.

Эффект появления коричневой окраски (потемнение) сыра моццарелла обычно обусловлен наличием остаточного количества редуцирующих сахаров - лактозы и галактозы, которое сохраняется в сыре после его производства. Поэтому множество попыток ослабить появление коричневой окраски основывалось на снижении содержания этих сахаров, в частности содержания галактозы, в сыре.

В традиционном способе получения моццареллы при обычной технологической обработке микроорганизм, вызывающий ферментативные процессы, ферментирует только глюкозную часть лактозы, а галактозу выделяет в среду. После этого в процессе технологической обработки сыр подвергается промывке, однако, как правило, галактоза и лактоза остаются в сыре в количестве 0,2-0,5% (масс.). В публикации dr. Norman Olson, Daily Record, June 1983, p. 112-113 говорится, что степень коричневой окраски моццареллы зависит от наличия свободных аминокислот и концентрации сахара в сыре, и появление коричневой окраски можно предотвратить удалением этих реагентов, обычно сахара. В публикации также дается ссылка на высокую корреляцию между содержанием галактозы и интенсивностью окрашивания сыра при выпекании. В литературе описано большое количество попыток понизить содержание галактозы и лактозы в моццарелле.

В патенте США 3531297 описан способ изготовления моццареллы, включающий стадию вымачивания сгустка в теплой воде для экстрагирования лактозы из сыра и снижения таким образом конечного содержания лактозы в сыре. Обычно, более низкое содержание лактозы в конечном продукте - моццарелле - соответствует меньшей тенденции сыра к образованию пузырей, подгоранию или обугливанию во время выпекания при высокой температуре.

Хотя способ, описанный в патенте США 3531297, нашел широкое коммерческое применение в США и являлся предпочтительным, он все же имеет определенные недостатки. Используемые большие емкости для вымачивания сгустка повышают расходы на оборудование и производственную площадь, а отработанная после вымачивания вода, содержащая лактозу, молочную кислоту и другие вещества, может значительно повысить расходы на утилизацию отходов предприятия. Другим ограничением способа по патенту США 3531297 является то, что весь технологический процесс от сырной ванны до смесительной машины должен точно рассчитываться по времени и стадиям и осуществляться в непрерывном режиме работы. На практике это означает, что оператор должен почти сразу же по окончании вымачивания проводить смешивание сыра.

В патенте США 4085228 описывается сыр моццарелла с низким содержанием влажности, полученный с использованием стандартной заквасочной культуры и дополнительной культуры, выбранной из Pediococcus cerevisiae, Lactobacillus plantarum, Streptococcus faecalis, Streptococcus durans и Lactobaccillus casei или их смесей. Хотя сыр получен с помощью обычных стадий технологической обработки, содержание лактозного сахара (и/или его моносахаридных производных) в нем снижено, благодаря добавлению культуры, метаболизирующей остаточную лактозу в процессе выдерживания при пониженной температуре в конце процесса. В соответствии с патентом США 4085228 полученный сыр обладает улучшенными качествами, которые важны для приготовления пиццы, причем он по существу не подгорает и имеет улучшенные характеристики плавления, вкуса и цвета. Однако комбинирование двух или нескольких заквасочных культур усложняет производство сыра моццарелла и, кроме того, полученный сыр все-таки будет содержать небольшие количества галактозы и лактозы, вовлекаемые в реакцию Майяра.

В публикации Mukherjee, K.K.; Hutkins, R.W., Journal of Dairy Science 1994, 77 (10) 2839-2849 показано, что применение в качестве заквасочной культуры микроорганизма, ферментирующего галактозу и не высвобождающего ее в среду, может приводить к получению сыра моццарелла со слабым коричневым окрашиванием. При использовании указанного микроорганизма в сыре моццарелла было достигнуто содержание галактозы ниже 0,1%.

В соответствии с публикацией M.A. Rudan, D.M. Barbano, 1977, J. Dairy Sci 81:2312-2319, проблема, связанная с чрезмерным коричневым окрашиванием и пригоранием сыра моццарелла, является более выраженной при использовании сыра с пониженным содержанием жира (например, 0,25-5,8% жира), чем в случае сыра обычной жирности (например, с содержанием 21% жира). Обсуждается, что проблема чрезмерного окрашивания вызывается слишком быстрым высыханием поверхности сыра, что приводит к подгоранию. В указанной публикации эта проблема решалась распылением на поверхность сыра слоя растительного масла.

В обзорной публикации A.H. Jana, Indian Dairyman 44, 3, 1992, p. 129-132 упоминаются проблемы потемнения сыра на выпеченной пицце. Указывается, что данная проблема связана с остатками галактозы и лактозы в сыре. Предложен ряд мер для уменьшения этой проблемы путем регулирования содержания галактозы. К таким мерам относятся:

- применение специфических комбинаций бактерий видов Streptococcus и Lactobacillus, способных ферментировать галактозу; эта комбинация должна приводить к снижению содержания галактозы в сыре;

- улучшенная промывка сгустка горячей водой с температурой 60-80°С на последней стадии нагрева;

- стекание сгустка при рН выше 6,3, при котором ферментируется большинство остающейся лактозы и галактозы;

- смягчение температурного режима обработки при получении плавленого сыра моццарелла;

- быстрое охлаждение сыра моццарелла после плавления для контролирования содержания галактозы в сыре;

- сокращение периода выдержки в рассоле, избегая избыточного содержания соли в водной фазе и позволяя молочной закваске ферментировать большинство остаточного сахара;

- хранение сыра в течение как можно более короткого периода для уменьшения протеолитического образования свободных аминогрупп, способных взаимодействовать с галактозой.

Многие из способов ослабления ненужного коричневого окрашивания, указанные в публикации Jana, основаны на очень строгом контроле или технологических модификациях, которые трудно поддаются управлению и/или могут повышать стоимость или снижать выход продукта.

Добавление в сыр ферментов в процессе его получения известно в данной области техники. Например, в патенте США 5626893 описано применение глюкозооксидазы в качестве поглотителя кислорода в ингибиторе спекания, используемом в сыре.

Данное изобретение решает проблемы уровня техники.

Заявленные объекты изобретения определены в прилагаемой формуле изобретения.

Авторами было обнаружено, что вызываемая реакцией Майяра проблема коричневого окрашивания пищевых продуктов, содержащих белок и редуцирующий сахар, в частности хлебопекарных изделий, может контролироваться путем контактирования пищевого продукта с ферментом, способным окислять восстанавливающую группу сахара. Это новый подход, при котором для предотвращения реакции Майяра редуцирующий сахар окисляется путем контактирования пищевого продукта с ферментом, способным осуществить необходимое окисление и таким образом удалить редуцирующий сахар из пищевого продукта.

В данном описании термин «предотвратить и/или уменьшить реакцию Майяра» означает, что степень реакции Майяра уменьшается, и/или период времени, необходимый для завершения реакции Майяра, увеличивается.

В некоторых вариантах фермент, предпочтительно, способен окислять восстанавливающую группу моносахарида и восстанавливающую группу дисахарида.

В некоторых вариантах фермент, предпочтительно, представляет собой гексозооксидазу (GOX) (ЕС1.1.3.5) или глюкозооксидазу (ЕС1.1.3.4). В очень предпочтительном варианте фермент представляет собой гексозооксидазу (HOX). Предпочтительно НОХ получают или приготавливают в соответствии с публикацией WO 96/40935.

Гексозооксидаза (HOX) является предпочтительной, поскольку глюкозооксидаза (GOX) обладает гораздо более высокой специфичностью в отношении глюкозы и может не исключать возможную реакцию Майяра, вызванную другим сахаром, таким как галактоза и лактоза. Поэтому глюкозооксидаза имеет ограниченное применение для снижения реакции Майяра в пищевых системах. В молочных продуктах, таких как сыр, галактоза и лактоза являются главными компонентами, ответственными за реакцию Майяра.

Гексозооксидаза (НОХ) представляет собой углеводную оксидазу, впервые полученную из красной морской водоросли Chondrus crispus. Как обсуждалось в публикации WO 96/39851, НОХ катализирует взаимодействие кислорода с углеводами, такими как глюкоза, галактоза, лактоза и мальтоза. По сравнению с другими окислительными ферментами, такими как GOX, HOX катализирует окисление не только моносахаридов, но и дисахаридов (Biochemica et Biochemica Acta, 309 (1973), 11-22).

Превращение глюкозы HOX протекает в соответствии с уравнением:

В водной среде после этого глюконолактон гидролизуется с получением глюконовой кислоты

Как показано, действие НОХ приводит к окислению углевода на восстановительном конце молекулы при 1-углероде и тем самым исключает возможность участия углевода в реакции Майяра.

В предпочтительном варианте фермент способен окислять сахар пищевого продукта в положении 1 («по связи 1»). Данный признак является предпочтительным, поскольку гарантирует такое окисление редуцирующего сахара, при котором восстанавливающая группа сахара более не способна вступать в реакцию Майяра. И наоборот, галактозооксидаза, например, окисляет галактозу на атоме углерода в положении 6, оставляя восстанавливающий конец неизмененным. Следовательно, после обработки галактозооксидазой (GOX) реакция Майяра может происходить. При получении сыра часто происходит накопление галактозы, поскольку микроорганизм, используемый для получения сыра, может не усваивать галактозу. Следовательно, можно предположить, что галактозооксидаза должна быть способна удалять галактозу и снижать тенденцию к реакции Майяра. Однако к данному предпочтительному варианту это явно не относится.

В некоторых вариантах редуцирующий сахар, предпочтительно, представляет собой лактозу или галактозу.

В некоторых вариантах редуцирующий сахар представляет собой галактозу.

В некоторых вариантах пищевой продукт, предпочтительно, выбирают из молочного пищевого продукта; пищевого продукта на основе молока или пищевого продукта, содержащего молоко, такого как выпечной продукт с сыром (gratin); пищевого продукта на основе яиц; пищевого продукта, содержащего яйца; хлебопекарных изделий, в том числе тостов, хлеба, кексов; и пищевых продуктов, полученных с использованием поверхностной или глубокой жарки, например рулеты.

Когда пищевой продукт представляет собой молочный пищевой продукт, он, предпочтительно, представляет собой сыр, более предпочтительно сыр моццарелла.

Когда пищевой продукт представляет собой сыр, данное изобретение особенно выгодно. Фермент, используемый по изобретению, такой как НОХ, способен удалять из сыра, например из тертого сыра, редуцирующие сахара. Поэтому остаточное содержание лактозы в сыре более не является определяющим фактором. Таким образом, можно сократить количество стадий промывания сырной массы в процессе получения сыра. При сокращении количества стадий промывания уменьшается также требуемое количество промывной воды, а выход сыра повышается.

В некоторых вариантах пищевой продукт, предпочтительно, представляет собой картофель или часть картофеля. Авторами было установлено, что при тепловой обработке картофеля способ по изобретению уменьшает нежелательное потемнение. Типичными продуктами из картофеля, для которых может использоваться данное изобретение, являются жареный картофель и хрустящий картофель (чипсы).

Фермент может контактировать с пищевым продуктом в процессе его изготовления или после его изготовления, но до того, как пищевой продукт подвергнется действию условий, которые могут привести к нежелательной реакции Майяра. В первом случае фермент должен вводиться в пищевой продукт. В последнем случае фермент должен присутствовать на поверхности пищевого продукта. Когда фермент присутствует на поверхности продукта, реакция Майяра предотвращается, поскольку именно поверхность продукта подвергается сушке и действию атмосферного кислорода, принимающего основное участие в реакции Майяра.

Для контактирования с пищевым продуктом в процессе его изготовления фермент может вводиться на любой подходящей стадии его изготовления. В варианте, когда пищевой продукт представляет собой молочный продукт, он может контактировать с молоком в процессе заквашивания молока и образования молочного сгустка. В данном способе фермент (такой как НОХ) неактивен в анаэробных условиях, создаваемых в процессе заквашивания и осаждения молочного белка, но будет активным в молочном продукте, таком как сыр, в аэробных условиях. В аэробных условиях фермент окисляет редуцирующий сахар и снижает тенденцию реакции Майяра.

При нанесении фермента на поверхность пищевого продукта фермент может наноситься любым подходящим способом.

Обычно фермент поставляют в растворе или дисперсии и распыляют на пищевой продукт. Раствор/дисперсия может включать фермент в количестве 1-50 единиц фермента/мл, например, 1-50 единиц гексозооксидазы/мл.

Фермент может также добавляться в сухой или порошкообразной форме. Во влажной или сухой форме фермент может объединяться с другими компонентами для контактирования с пищевым продуктом. Например, когда фермент находится в сухой форме, он может объединяться с противослеживающим агентом.

В некоторых вариантах изобретение дополнительно включает стадию контактирования пищевого продукта с каталазой.

В предпочтительном варианте пищевой продукт после контакта с ферментом помещают в непроницаемый для кислорода контейнер. Авторами было установлено, что фермент при взаимодействии с редуцирующим сахаром потребляет кислород, находящийся внутри контейнера. Потребление кислорода будет снижать микробиологическую активность в пищевом продукте и увеличивать срок хранения. Значит можно обойтись без упаковывания в контролируемой атмосфере.

Когда пищевой продукт после контакта с ферментом расфасовывается в контейнер, непроницаемый для кислорода, важно чтобы пищевой продукт мог выдерживаться некоторое время перед расфасовкой или чтобы он помещался в контейнер с некоторым количеством кислорода. Происходящая в данном способе реакция, предотвращающая реакцию Майяра, включает окисление восстанавливающей группы сахара. Для осуществления этой реакции требуется кислород. Если пищевой продукт упакован без выдерживания или без некоторого количества кислорода в контейнере, то такая реакция, противодействующая реакции Майяра, не произойдет, и желаемый результат данного изобретения может снизиться.

Авторами также было установлено, что фермент, используемый по изобретению, такой как НОХ, может быть достаточно активен при низких температурах, так что пищевой продукт может подвергаться охлаждению или заморозке после контакта с ферментом без необходимости проведения реакции фермента с редуцирующим сахаром при комнатных температурах. Это особенно важно при получении продуктов питания, выдерживание которых при повышенной температуре может привести к неприемлемому росту микроорганизмов. Таким образом, в предпочтительном варианте способ включает охлаждение продукта питания до температуры не выше 5°С, когда большинство редуцирующего сахара, присутствующего в пищевом продукте, контактирующего с ферментом, еще не окислена ферментом.

Специалисту в данной области техники понятно, что на практике в данном изобретении пищевой продукт будет контактировать с таким количеством фермента, которое будет достаточным для предотвращения и/или уменьшения реакции Майяра. Типичные количества фермента, для контактирования с пищевым продуктом, составляют от 0,05 до 5 единиц/г (единиц фермента на грамм пищевого продукта), от 0,05 до 3 единиц/г, от 0,05 до 2 единиц/г, от 0,1 до 2 единиц/г, от 0,1 до 1,5 единицы/г и от 0,5 до 1,4 единицы/г.

Данное изобретение далее описано более подробно на примерах, со ссылкой на прилагаемые фигуры, на которых:

фиг.1 - фотографии;

фиг.2 - фотографии;

фиг.3 - фотографии;

фиг.4 - фотографии;

фиг.5А - фотографии;

фиг.5В - фотографии;

фиг.6 - фотографии;

фиг.7 - фотографии;

фиг.8 - фотографии;

фиг.9 - график;

фиг.10 - фотография;

фиг.11 - график;

фиг.12 - график;

фиг.13 - график;

фиг.14 - фотография; и

фиг.15 - фотография.

ПРИМЕРЫ

Анализ внешнего вида

Внешний вид образцов по примерам анализировали следующим образом.

Запись внешнего вида образцов вели в нерассеянном свете с помощью трехчиповой CCD цветной видеокамеры с разрешением 440000 пикселей (JVC KY-F58E). Калибровку выполняли по серой шкале фирмы Кодак. С помощью компьютера (программа Adobe Photoshop, включая Plug Ins.) подготавливали изображения для количественной оценки изменения цвета образцов, выраженного в виде цветовой интенсивности всего образца, и вычисляли значения интенсивности окрашивания потемневшей части образца и, дополнительно, относительную площадь потемневшей части. В процессе коричневого окрашивания образца интенсивность серого значительно уменьшалась, и затемненные площади определяли как площади с интенсивностью серого менее 100. Общая цветовая интенсивность изменялась в пределах 0-255 (8 битовая шкала), где 0 - отсутствие интенсивности и 255 - полная интенсивность. Калибрование интенсивности гарантировало сравнимость измерений в различных сериях.

Интенсивность каждого пикселя вычисляли в виде среднего значения интенсивностей для красного, зеленого и синего цвета.

Затем вычисляли среднее значение интенсивности цвета в виде средней интенсивности цвета всех пикселей в образце и в потемневшей части образца соответственно. Относительную площадь потемневшей части вычисляли как соотношение между количеством пикселей в темной части образца к общему количеству пикселей всего образца.

Пример 1 - Пицца с сыром моццарелла

20 г сыра моццарелла (фирмы Karolone's Dansk, 25% белка, 1% углеводов и 21% жира) помещали в стакан. На сыр распыляли 1 мл раствора гексозооксидазы. Сыр хранили в течение 2 часов при комнатной температуре. Из муки, соли и воды изготавливали тесто. Отделяли 10 г теста и помещали в чашку Петри. 5 г сыра моццарелла помещали сверху на тесто и полученное тесто выпекали при 225°С в течение 7 минут. Второй образец выпекали в течение 15 минут. После выпекания образцы визуально оценивали. Образцы показаны на фиг.1.

Из этого эксперимента стало ясно, что нанесение на сыр гексозооксидазы ослабляет коричневое окрашивание в результате уменьшения реакции Майяра. Кроме того, в образцах, которые потемнели, данное изобретение обеспечивало более равномерное коричневое окрашивание без черного пригорания.

Пример 2

Сыр моццарелла обрабатывали способом, показанным в таблице 1, в соответствии с методикой по примеру 1.

Таблица 1
Опыт №	Сыр, г	Вода, г	НОХ, ед./гсыра	Время хранения, часы	Температура хранения,°С
1	30	1,3	0	20	20
2	30	1,3	0,01	20	20
3	30	1,3	0,05	20	20
4	30		0	20	20
5	30	1,3	0,01	20	5
6	30	1,3	0,05	20	5
7	30	1,3	0,3	20	5
8	30	1,3	0,3	20	5

После обработки образцы сыра помещали на тесто и выпекали в течение 12 минут при 225°С. После выпекания образцы визуально оценивали. Полученные образцы представлены на фиг.2.

Результаты показали, что обработка сыра ферментом в количестве 0,05 ед. НОХ на г сыра является достаточной для уменьшения коричневого окрашивания сыра, хранящегося при 20°С. Результаты также показывают, что потемнение уменьшается, даже если сыр, обработанный НОХ, хранят при 5°С.

Пример 3

Сыр моццарелла обрабатывали в соответствии с условиями, описанными в таблице 2, по методике примера 1.

Таблица 2
Опыт №	Сыр, г	Фермент
1	20	Контроль, 1 мл воды
2	20	1 мл гексозооксидазы, 0,75 ед./мл
3	20	1 мл галактозооксидазы 63 ед./мл
4	20	1 мл глюкозооксидазы, 260 ед./мл

После хранения в течение 20 часов при 20°С образцы сыра вносили в тесто и выпекали при 225°С в течение 7 минут. Образцы выпеченного сыра моццарелла визуально оценивали. Полученные образцы показаны на фиг.3.

Результаты ясно показывают, что гексозооксидаза эффективно снижает степень реакции Майяра. Глюкозооксидаза и галактозооксидаза лишь ограниченно влияют на степень реакции Майяра.

Пример 4

Данное исследование проводили для изучения эффекта применения фермента, в частности гексозооксидазы, в различных условиях. Это исследование проводили для установления того, может ли способ внесения гексозооксидазы в сыр моццарелла быть определяющим параметром для предотвращения реакции Майяра в сыре моццарелла, который хранят обычно при 5°С и расфасовывают в контролируемых условиях.

Данные, представленные в таблице 3, получены с использованием сыра моццарелла (фирмы Karoline's Dansk, 25% белка, 1% углеводов и 21% жира).

Таблица 3
Опыт №	Гексозооксидаза, ед./г сыра	Время хранения перед расфасовкой, часы	Условия расфасовки
1	0,1	0,5	Воздух
2	1	0,5	Воздух
3	Контроль	1,5	Воздух
4	0,1	3	Воздух
5	1	3	Воздух
6	0,1	0,5	Вакуум
7	1	0,5	Вакуум
8	Контроль	1,5	Вакуум
9	0,1	3	Вакуум
10	1	3	Вакуум

Образцы помещали в алюминиевые пакеты. Половину образцов расфасовывали в вакуумные упаковки, другую половину расфасовывали с обычным атмосферным воздухом. Все образцы хранили при 5°С. После хранения в течение 1 недели образцы сыра выпекали в течение 12 минут способом по примеру 1. После выпекания проводили оценку образцов. Полученные образцы показаны на фиг.4.

Результаты четко показали влияние добавленной к сыру НОХ. Результаты также показали, что уменьшение реакции Майяра может быть достигнуто как для продуктов, расфасованных в упаковки с воздухом, так и для продуктов, помещенных в вакуумные упаковки, после выдержки в течение некоторого периода.

Пример 5

Влияние гексозооксидазы на коричневое окрашивание выпечного продукта (gratin) определяли в соответствии со следующей методикой.

75 г шортенинга (т.пл. 35°С) и 100 г муки нагревали в емкости при перемешивании. При перемешивании добавляли 350 мл снятого молока (предварительно нагретого до 90°С). Добавляли соль и перец. Белок и желток отделяли у 4 яиц. Желтки добавляли отдельно. Белки взбивали до пены с 10 г пекарского порошка и осторожно смешивали с получением теста. Тесто выкладывали на 2 алюминиевых противня. Один противень опрыскивали раствором гексозооксидазы (7,5 ед./мл) и выдерживали при комнатной температуре в течение 230 минут. После этого продукт выпекали в печи с циркуляцией воздуха при 175°С в течение 20 минут. После выпекания внешний вид продукта оценивали визуально. Полученные образцы представлены на фиг.5А. Образцы дополнительно обрабатывали в соответствии с условиями, описанными в таблице 6 ниже.

Таблица 6
Образец	Добавленный фермент	Интенсивность коричневого цвета
1	0,1 мл воды		117
2	0,1 мл раствора НОХ	0,75 ед./мл	109
3	0,1 мл раствора НОХ	1,50 ед./мл	119
4	0,1 мл раствора НОХ	7,50 ед./мл	134
5	Контроль		116

После выпекания продукт оценивали визуально. Полученные образцы показаны на фиг.5В. Измерение интенсивности коричневого цвета в соответствии с описанной выше методикой показало, что раствор НОХ, содержащий 7,5 ед./мл, дал меньшее коричневое окрашивание (большие значения соответствуют меньшей интенсивности окрашивания). Другие значения интенсивности коричневого цвета незначительно отличаются от контроля.

Результаты показывают, что применение НОХ дает менее темную поверхность выпечного продукта, что свидетельствует о снижении реакции Майяра.

Пример 6

Влияние НОХ на коричневое окрашивание сыра моццарелла изучали на сыре моццарелла низкой жирности (состав: 13% жира, 33% белка и 1,5% углеводов). Образцы сыра обрабатывали следующим образом:

1: Контроль - 1 мл воды добавляют к 20 г сыра.

2: 0,2 мл НОХ (7,5 ед./мл) добавляют к 20 г сыра.

3: 1 мл НОХ (7,5 ед./мл) добавляют к 20 г сыра.

Фермент наносили путем распыления раствора фермента на тертый сыр. Образцы хранили при 5°С в течение 20 часов, а затем наносили на тесто, выложенное на алюминиевый противень, и выпекали в течение 10 минут при 225°С в печи с циркуляцией воздуха. После выпекания оценивали вид образцов. Образцы показаны на фиг.6.

Результаты четко показали способность НОХ уменьшать коричневое окрашивание сыра моццарелла пониженной жирности. Они также показали, что уменьшение потемнения зависит от содержания гексозооксидазы.

Пример 7

Влияние гексозооксидазы на коричневое окрашивание сыра моццарелла изучали распылением различных количеств НОХ на сыр моццарелла. После распыления раствора НОХ сыр выдерживали в течение 30 минут или 3 часов при комнатной температуре, а затем помещали в алюминиевую вакуумную упаковку. Через 14 дней хранения при 5°С образцы сыра наносили на тесто пиццы и выпекали в течение 8 минут при 225°С. После выпекания вид образцов оценивали визуально, а изображения образцов анализировали методом анализа внешнего вида. Образцы по данному примеру показаны на фиг.7. Результаты анализа внешнего вида представлены в таблице 7.

Таблица 7
Опыт №	Гексозооксидаза, ед./г сыра	Время хранения перед расфасовкой, часы	Интенсивность окраски пиццы	Интенсивность потемнения	% темной площади
1	0,1	0,5	125	106	61
2	0,1	3	146	122	22
3	1	0,5	173	125	0,9
4	1	3	172	127	0,6
5	Контроль	1,5	123	107	63

Из фиг.7 видно, что при добавлении гексозооксидазы к сыру моццарелла реакция коричневого окрашивания в значительной степени уменьшается. Из фиг.7 также видно, что интенсивность окрашивания зависит от дозы НОХ. Также видно, что длительность выдержки перед расфасовкой в вакуумную упаковку является важным фактором. В частности, при дозе 0,1 ед./г, выдержки 0,45 часа оказалось недостаточно для существенного уменьшения реакции Майяра. Различия, показанные на фиг.7, подтверждаются изменением интенсивности окрашивания, где меньшее значение показывает большее потемнение продукта. Кроме того, площадь коричневого окрашивания, выраженная в %, также в значительной степени зависит от добавления НОХ к сыру.

Пример 8

Метод определения активности гексозооксидазы (НОХ-оценка).

НОХ-оценка основана на изменении количества пероксида водорода, выделенного при окислении глюкозы. Пероксид водорода окисляют ABTS в присутствии пероксидазы с получением окрашивания.

Реагенты

100 мМ фосатного буфера, рН 6,3.

55 мМ D-глюкозы (SIGMA, G-8270) в 100 мМ фосфатного буфера, рН 6,3.

ABTS (SIGMA, A 1888), 5,0 мг/мл в дистиллированной воде.

Пероксидаза (SIGMA, P-6782), 0,10 мг/мл в 100 мМ фосфатного буфера, рН 6,3.

Субстрат:

4,60 мг реагента 2

0,200 мл реагента 3

0,200 мг реагента 4

Опыт

290 мкл субстрата и 10 мкл ферментного раствора

Реакцию инициировали добавлением раствора фермента. Смесь выдерживали при 25°С и кинетику реакции изменяли в течение 10 минут на спектрофотометре (405 нм). Контрольный образец содержал все компоненты, за исключением ферментного раствора, который заменили водой. По результатам изменения вычисляли угол наклона кривой OD/min.

Стандартная кривая пероксида водорода

Стандартная кривая пероксида водорода может быть построена с использованием различных концентраций свежего раствора Н₂О₂ (пергидроль, MERK 107298). Единица ферментной активности определяется как количество фермента, которое производит 1 мкмоль Н₂О₂ в минуту при 25°С.

Пример 9

Влияние НОХ на коричневое окрашивание сыра пиццы определяли в смеси с каталазой. Каталазу добавляли в комбинации с НОХ для удаления пероксида водорода, получаемого при каталитической конверсии лактозы и галактозы в соответствующие кислоты, поскольку пероксид водорода может принимать участие в некоторых нежелательных побочных реакциях и изменять вкус посредством, например, липидного окисления.

Каталаза катализирует следующую реакцию:

В данном опыте 60 г сыра моццарелла (фирмы Karoline's Dansk 25% белка, 1% углеводов и 21% жира) обрабатывали количествами фермента, указанными в таблице 7.

Таблица 7
Опыт №	Единиц НОХ/г сыра	Единиц каталазы/г сыра
1	0	0
2	0,5	0
3	0	1
4	0,5	1
5	0,17	0,33

Использовали каталазу фирмы SIGMA, № по каталогу С3515.

Методика: Растворами фермента НОХ и каталазы опрыскивали сыр моццарелла, затем оставляли его при комнатной температуре на 2 часа. Сыр обрабатывали 8 г фермента, затем наносили на 16,7 г теста, помещенного на алюминиевый противень, и выпекали при 275°С в течение 6 минут.

Результаты экспериментов выпекания представлены на фиг.8.

Из результатов, представленных на фиг.8, видно, что добавление 0,5 ед. НОХ/г сыра (опыт 2) уменьшает реакцию Майяра и приводит к ослаблению потемнения сыра. Такой же эффект наблюдается, когда 0,5 ед. НОХ/г объединяют с 1 ед. каталазы/г (опыт 4). Каталаза сама по себе (опыт 3) не влияет на реакцию Майяра.

Пример 10

В описанных выше примерах показано, что НОХ способна окислять редуцирующие сахара в сыре моццарелла и таким образом снижать тенденцию к реакции Майяра при выпекании сыра моццарелла.

В этих экспериментах НОХ наносили распылением раствора НОХ на сыр. Это может создавать проблемы обработки, поскольку сыр становится влажным и клейким, и это может ограничить применение измельченного сыра на пицце и других пищевых продуктах.

Для решения этой проблемы авторы наносили НОХ на сыр моццарелла в виде порошка. Этот способ добавления фермента является очень удобным, поскольку обычно противослеживающий агент, такой как крахмал, добавляют к тертому сыру, например, моццарелле, для предотвращения ее слипания при хранении.

В описанном ниже эксперименте НОХ добавляли в виде порошка к сыру мацарелла в двух концентрациях: 1 ед./г и 0,1 ед./г сыра при температурах 25°С и 5°С.

Эксперимент

НОХ в форме порошка смешивали с картофельным крахмалом. 1,5 г картофельного крахмала с НОХ смешивали с 98,5 г сыра моццарелла с получением конечной дозы 1 ед. НОХ на грамм сыра. Для контроля сыр смешивали с картофельным крахмалом без НОХ.

Пример 10a

100 г сыра помещали в банку с крышкой (310 мл), в банку помещали датчик кислорода, и банку герметично закрывали крышкой. Регистрировали расход кислорода по времени.

Добавление 1 ед. НОХ/г сыра испытывали при 25°С, содержание кислорода в банке записывали как функцию от времени. Результаты представлены на фиг.9. Из фиг.9 видно, что НОХ также активна при добавлении к сыру в форме порошка. Этот факт является неожиданным, поскольку можно было предположить, что НОХ, добавленная в виде порошка в условиях с пониженным содержанием воды, может быть менее эффективна.

Как показано на фиг.9, весь кислород в банке израсходован НОХ.

Исходя из объема воздуха в банке, вычислено, что израсходовано 0,018 моль кислорода. Зная, что НОХ окисляет один моль лактозы с использованием одного моля кислорода, можно определить, что окислено 0,62% лактозы. Зная приблизительное обычное содержание остаточного сахара в сыре моццарелла, можно заключить, что почти весь редуцирующий сахар окислен. Это доказывает, что в сыре происходит диффузия сахара или НОХ.

Пример 10b

Через один день 10 г сыра помещали на алюминиевый противень и выпекали при 275°С в течение 6 минут. Результаты опыта выпекания показаны на фиг.10. Из фиг.10 видно, что НОХ уменьшает потемнения при выпекании.

Пример 10с

В следующем эксперименте добавляли только 0,1 ед. НОХ/г сыра, и 100 г сыра хранили при 25°С в закрытой банке (310 мл) с датчиком кислорода. Потребление кислорода по времени показано на фиг.11.

Как и ожидалось, реакция замедлялась, поскольку добавляли меньше НОХ, но из данного эксперимента видно, что основная часть