Полипептид с активностью фосфолипазы и его применение

Полипептид с активностью фосфолипазы и его применение

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к способу гидролиза фосфолипида, к способу получения фосфолипазы, к способу получения сыра и к фосфолипазе.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Сораньи с соавт. (Soragni, E., et al. (2001) EMBO J. 20:5079-5090) описывает фосфолипазу (TbSP1) из Tuber borchii и нуклеотидную последовательность к ДНК гена, кодирующего ее. Ниже приведена информация по разным источникам о пептидной последовательности, полученной из указанных ниже организмов:

- COGEME Phytoраthogenic Fungi and Oomycete EST Database, Unisequence ID: VD0100C34, Vetricillium dahliae

- NCBI Protein database, gi: 18307435, Neurospora crassa

- NCBI Protein database, gi: 16519372, Helicosporum sp. NH1

- WO 0056762, SEQ ID NO: 5954, Aspergillus oryzae

- TREMBL Protein database, EAA28927, Neurospora crassa

В US 6399121 описывается использование фосфолипазы при получении сыра.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторы настоящего изобретения проанализировали известные данные по последовательностям для грибных фосфолипаз А2 из группы XIII и идентифицировали дополнительные последовательности либо на основе данных, приведенных в опубликованных источниках по последовательностям, либо при скрининге соответствующих последовательностей из природных источников. Авторы показали, что при экспрессии генов, кодирующих грибные фосфолипазы А2 из группы XIII, в соответствующем организме-хозяине экспрессированные последовательности состоят из корового пептида, соединенного с пептидной последовательностью на N- или C-концевой стороне, или на обеих сторонах, при этом экспрессия гена в соответствующем организме-хозяине может вести к расщеплению экспрессируемого пептида с получением корового пептида без удлиняющего пептида, достигающего N- или C-конца. Они также показали, что коровый пептид, не включающий какого-либо пептидного удлинения пептида, обладает значительно более высокой активностью фосфолипаз, чем коровый пептид, соединенный с пептидным(ыми) удлинением(ями). И наконец, они показали, что найденный ими при использовании данного способа коровый пептид аналогичен по длине и последовательности известному зрелому пептиду из Helicosporum sp. (Wakatsuki, S. et al. (2001) Biochim. Biophys. Acta 1522: 74-81) с неизвестной функцией и к бактериальным фосфолипазам А2 из группы XIII, в которых отсутствуют пептидные удлинения, отличные от тех, которые относятся к сигналам секреции (Sugiyama, M. et.al. (2002) J. Biol. Chem. 277: 20051-20058).

Кроме того, авторы изобретения обнаружили, что фосфолипаза, обладающая сходством по последовательности активного сайта и по уровню консервативности по цистеиновому остатку с грибной фосфолипазой А2 из группы XIII, полезна для получения сыра.

Кроме того, авторы изобретения обнаружили и выделили ген, кодирующий новую фосфолипазу из Fusarium venenatum A3/5, который был вначале депонирован как Fusarium graminearum ATCC 20334, а затем классифицирован как Fusarium venenatum (Yoder and Christianson, 1998, Fungal Genetics and Biology 23: 62-80 и O'Donnel et al., 1998, Fungal Genetics and Biology 23: 57-67). Данная фосфолипаза принадлежит к грибной/бактериальной группе XIII PLA2, в соответствии с определением Сораньи с соавт. (Soragni, E., et al., 20 (2001) EMBO J 20:5079-5090). Авторы изобретения также клонировали ген, кодирующий новую фосфолипазу, в штамме E. coli и затем использовали клонированный ген для создания конструкции, экспрессирующей ген фосфолипазы из Fusarium в Aspergillus oryzae. Авторы изобретения трансформировали Aspergillus oryzae данной конструкцией и выделили фосфолипазу из трансформированных клеток Aspergillus.

Соответственно, настоящее изобретение относится к способу получения фосфолипазы, который включает процессинг экспрессированного грибного пептида, позволяющий отщепить пептид от С-концевого конца и/или пептид от N-концевого конца с получением корового пептида, где коровый пептид включает:

а) аминокислотную последовательность, образованную аминокислотами 146-153 из SEQ ID NO: 1, аминокислотами 87-94 из SEQ ID NO: 3 или аминокислотами 79-86 из SEQ ID NO: 12, или последовательность, идентичную любой из указанных аминокислотных последовательностей, за исключением замещения одной аминокислоты другой аминокислотой; и

b) по меньшей мере два цистеиновых остатка, расположенных на N-концевом участке последовательности, приведенной в а); и

с) по меньшей мере два цистеиновых остатка, размещенных на С-концевом участке последовательности, приведенной в а).

Изобретение также относится к способу гидролиза фосфолипида фосфолипазой по настоящему изобретению. Кроме того, изобретение относится к способу получения сыра путем взаимодействия молока для сыроделия или фракции такого молока с фосфолипазой с последующим получением сыра из указанного молока для сыроделия.

И наконец, настоящее изобретение относится к фосфолипазе, которая является полипептидом с аминокислотной последовательностью, которая по меньшей мере на 80% идентична отдельным идентифицированным последовательностям.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Экспрессированный пептид

В практике осуществления настоящего изобретения используется экспрессированный грибной пептид, принадлежащий к группе, определяемой на основе сходства последовательностей активного сайта и уровня консервативности по цистеиновому остатку, как параметров, используемых при определении группы «фосфолипаза А2 из грибной/бактериальной группы XIII», в соответствии с предложением Сораньи с соавт. (Soragni, E., et al. (2001) EMBO J. 20:5079-5090). Пептид имеет грибную природу, то есть получен из Tuber, Verticillium, Neurospora, Helicosporum или Aspergillus, в особенности T. borchii, T. albidum, V. dahliae, V. tenerum, N. crassa, Helicosporum sp. HN1 или A. oryzae.

Пептид может обладать фосфолипазной активностью, например, активностью фосфолипазы А, такой как активность фосфолипазы А1 и/или активность фосфолипазы А2.

Некоторые конкретные примеры представляют собой известные пептиды с аминокислотными последовательностями, перечисленными ниже в перечне последовательностей. Ниже указаны организмы-источники и соответствующие литературные ссылки:

- SEQ ID NO: 1. Tuber borchii, Soragni, E., et al., (2001) EMBO J. 20:5079-5090;

- SEQ ID NO: 3. Vetricillium dahliae, COGEME Phytoраthogenic Fungi and Oomycete EST Database, Unisequence ID: VD0100C34;

- SEQ ID NO: 4. Neurospora crassa, NCBI Protein database, gi: 18307435;

- SEQ ID NO: 5. Helicosporum sp. NH1, NCBI Protein database, gi: 16519372;

- SEQ ID NO: 7. Aspergillus oryzae, WO 0056762, SEQ ID NO: 5954;

- SEQ ID NO: 8. Neurospora crassa, TREMBL Protein database, EAA28927.

Кроме того, авторами настоящего изобретения были выделены следующие грибные фосфолипазы с указанными ниже последовательностями, из природных источников, приобретенных из общественно доступных коллекций или собранных в указанной стране и в указанный год:

- SEQ ID NO: 10. Tuber albidum, Purshased from Centraalbureau voor Schimmelcultures, Utrecht, The Netherlands, изолят CBS272.72;

- SEQ ID NO: 12. Vetricillium tenerum, Ireland, 1996.

Авторы осуществили встраивание гена из T.albidum (SEQ ID NO: 9) в Е. coli и депонировали клон в Коллекции на условиях Будапештского договора 12 февраля 2003 года. Депонирование было осуществлено в Коллекции микроорганизмов и клеточных культур в Германии (Deutsce Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ), Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Germany) и ему был присвоен депозитарный номер DSM 15441.

В одном варианте настоящее изобретение относится к фосфолипазе, которая является полипептидом с аминокислотной последовательностью, которая по меньшей мере на 80%, например, по меньшей мере на 85%, предпочтительно на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 95%, идентична аминокислотам на участке 91-210 в SEQ ID NO: 10 (T.albidum), аминокислотам на участке 92-211 в SEQ ID NO: 1 (T. borchii), аминокислотам на участке 30-137 в SEQ ID NO: 12 (V. tenerum), аминокислотам на участке 38-145 в SEQ ID NO: 3 (V.dahliae), аминокислотам на участке 44-151 в SEQ ID NO: 4 (N. crassa), аминокислотам на участке 37-157 в SEQ ID NO: 7 (A oryzae) или аминокислотам на участке 58-168 в SEQ ID NO: 8 (N. crassa).

Процессинг пептида

Анализируя последовательности фосфолипазы, приведенных в перечне последовательностей, авторы изобретения обнаружили, что каждая экспрессированная аминокислотная последовательность состоит из сигнального пептида, корового пептида и дополнительной пептидной последовательности с неизвестной функцией, присоединенной к С- или N-концу, или к обоим концам корового пептида.

Коровый пептид

Коровые пептиды характеризуются одинаковым сходством последовательности активного сайта и уровнем консервативности по цистеиновому остатку, найденным Сораньи с соавт. (Soragni, E., et al., (2001) EMBO J. 20:5079-5090), с фосфолипазой А2 из грибной/бактериальной группы XIII.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения коровые пептиды включают: а) последовательность, образованную аминокислотами 146-153 в SEQ ID NO: 1, аминокислотами 87-94 в SEQ ID NO: 3 или аминокислотами 79-86 в SEQ ID NO: 12; или последовательность, идентичную любой из указанных аминокислотных последовательностей, за исключением замещения одной аминокислоты другой аминокислотой; и b) два цистеиновых остатка, расположенных на N-концевом участке последовательности, приведенной в а); и с) два цистеиновых остатка, расположенных на С-концевом участке последовательности, приведенной в а).

Один из цистеиновых остатков, расположенных на N-концевом участке последовательности, приведенной в а), может быть, например, отделен от последовательности, приведенной в а), 0-5 аминокислотами, например, 0-3 аминокислотами, предпочтительно 0-2 аминокислотами и еще более предпочтительно 1 аминокислотой. Другой из цистеиновых остатков, расположенных на N-концевом участке последовательности, приведенной в а), может быть, например, отделен от последовательности, приведенной в а), 14-20 аминокислотами, например, 15-19 аминокислотами, предпочтительно 16-18 аминокислотами и еще более предпочтительно 17 аминокислотами.

Один из цистеиновых остатков, расположенных на С-концевом участке последовательности, приведенной в а), может быть, например, отделен от последовательности, приведенной в а), 22-29 аминокислотами, например, 23-28 аминокислотами, предпочтительно 24-27 аминокислотами и еще более предпочтительно 25-26 аминокислотами. Другой из цистеиновых остатков, расположенных на С-концевом участке последовательности, приведенной в а), может быть, например, отделен от последовательности, приведенной в а), 27-49 аминокислотами, например, 29-46 аминокислотами, предпочтительно 30-43 аминокислотами, еще более предпочтительно 32-42 аминокислотами и наиболее предпочтительно 35-40 аминокислотами.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения коровый пептид включает четыре цистеиновых остатка, сопоставляемых с цистеиновыми остатками в SEQ ID NO: 1, под номерами 128, 144, 180 и 194, соответственно, когда полная экспрессированная последовательность фосфолипазы сопоставляется (выравнивается) одновременно с последовательностями, приведенными в SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 12.

Согласно настоящему изобретению, экспрессированный полипептид расщепляют, с тем чтобы отделить коровый пептид от присоединенного(ых) пептида(ов). Расщепление может быть осуществлено in vivo посредством экспрессии в клетке соответствующего нитевидного гриба-хозяина, или in vitro, например, при обработке соответствующей фосфолипазой, такой как Kex2.

Точки расщепления могут быть обнаружены в пределах 11 аминокислот в последовательности, которая представляет собой FG, или внутри 10 аминокислот в последовательности, которая представляет собой сайт Kex2. Сайты Kex2 представляют собой, например, RR, KR, KK или RK. В одном варианте осуществления изобретения коровый пептид имеет длину 100-150 аминокислот, например, 110-140 аминокислот, 115-133 аминокислоты, 118-129 аминокислот или 118-126 аминокислот.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения экспрессированную фосфолипазу расщепляют на участке, включающем 0-18 аминокислот, таком как участок из 3-16 аминокислот, предпочтительно 5-14 аминокислот, на N-концевом участке последовательности, при сопоставлении с аминокислотами 97-101 в SEQ ID NO: 1, когда полная экспрессированная последовательность фосфолипазы сопоставляется (выравнивается) одновременно с последовательностями, приведенными в SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 12.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения экспрессированную фосфолипазу расщепляют на участке, включающем 0-11 аминокислот, таком как участок из 0-9 аминокислот, предпочтительно 0-7 аминокислот, на С-концевом участке последовательности, при сопоставлении с аминокислотами 204-209 в SEQ ID NO: 1, когда полная экспрессированная последовательность фосфолипазы сопоставляется одновременно с последовательностями, приведенными в SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 12.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения процессированная фосфолипаза обладает удельной фосфолипазной активностью, которая выше, чем активность экспрессированного пептида до процессинга, например, в одном варианте удельная активность фосфолипазы по меньшей мере в 2 раза, более предпочтительно по меньшей мере в 5 раз, более предпочтительно по меньшей мере в 10 раз превышает удельную активность фосфолипазы экспрессированного пептида до процессинга. В одном варианте осуществления настоящего изобретения экспрессированный пептид до процессинга не обладает измеряемой активностью фосфолипазы.

Активность фосфолипазы может быть, например, определена в тесте LEU при гидролизе соевого лецитина (L-альфа-фосфатидилхолин) при pH 8,0 и 40°С в течение 2 минут. Активность фосфолипазы выражают в виде относительного потребления титрующего агента (0,1 M NaOH), необходимого для поддержания постоянного pH, на фоне стандарта.

Экспрессия в клетках-хозяевах нитевидных грибов

Нитевидный гриб, взятый в качестве клетки-хозяина, может представлять собой, например Acremonium, Aspergillus, Fusarium, Humicola, Myceliophthora, Neurospora, Penicillium, Rhizomucor, Thermomyces, Thielavia, Tolypocladium или Trichoderma, в особенности A. awamori, A. foetidus, A. japonicus, A. nidulans, A. niger, A. oryzae, F. bactridioides, F. cerealis, F. crookwellense, F. culmorum, F. graminearum, F. graminum, F. heterosporum, F. negundi, F. oxysporum, F. reticulatum, F. roseum, F. sambucinum, F. sarcochroum, F. sporotrichioides, F. sulphureum, F. torulosum, F. trichothecioides, F. venenatum, H. insolens, M. thermophila, N. crassa, P. purpurogenum, R. miehei, Thermomyces lanuginosus, Thielavia terrestris, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei или Trichoderma viride.

В предпочтительном варианте организм хозяина представляет собой Aspergillus, Fusarium или Trichoderma, в особенности A. niger, A. oryzae, F. venenatum, F. sambucinum или F. cerealis.

Процедуры трансформации, культивирования, экспрессии и восстановления могут быть осуществлены традиционными способами, например, с использованием основных методик, описанных в EP 238023, EP 305216, WO 9600787, EP 244234 или в работе Кристенсена с соавт. (T. Christensen et al., BioTechnology, vol. 6, Dec. 1988, 1419-22).

Полипептид фосфолипазы и соответствующая ДНК

В одном варианте настоящее изобретение относится к полипептидам, обладающим фосфолипазной активностью, где указанные полипептиды включают аминокислотную последовательность (или предпочтительно состоят из нее), которая обладает идентичностью к аминокислотам 29-146 в SEQ ID NO: 16 (например, зрелому полипептиду) на уровне, равном по меньшей мере 80%, таком как по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 95%, например, по меньшей мере на уровне 96%, таком как по меньшей мере 97%, и еще более предпочтительно по меньшей мере 98%, таком как по меньшей мере 99%.

Предпочтительно полипептиды включают аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16; ее аллельный вариант или ее фрагмент, который обладает фосфолипазной активностью. В другом предпочтительном варианте полипептид по настоящему изобретению включает аминокислоты 29-149 из SEQ ID NO: 16. В еще одном предпочтительном варианте полипептид по настоящему изобретению состоит из аминокислот 29-146 из SEQ ID NO: 16.

Настоящее изобретение также относится к полинуклеотиду, который включает нуклеотидную последовательность (или предпочтительно состоит из нее), которая обладает по меньшей мере 80% идентичностью с нуклеотидами 133-495 в SEQ ID NO: 15. Предпочтительно нуклеотидная последовательность обладает идентичностью по меньшей мере на уровне 85%, такой как по меньшей мере 90% идентичность, предпочтительно по меньшей мере 95% идентичность, такой как по меньшей мере 96% идентичность, например, по меньшей мере 97% идентичность, еще более предпочтительно по меньшей мере 98% идентичность, например, по меньшей мере на уровне 99%, с нуклеотидами 133-495 в SEQ ID NO: 15. Предпочтительно нуклеотидная последовательность кодирует полипептид, обладающий фосфолипазной активностью.

Фосфолипаза может быть получена из штамма Fusarium, в особенности F. Venenatum, с использованием зондов, разработанных на основе последовательностей ДНК, приведенных в настоящем описании. В одном варианте фосфолипаза обладает активностью фосфолипазы А.

Фосфолипаза может быть получена путем трансформации соответствующей клетки-хозяина последовательностью ДНК, кодирующей фосфолипазу, с последующим культивированием трансформированного организма в условиях, обеспечивающих продуцирование фермента, и выделением фермента из культуры.

Организм хозяина представляет собой предпочтительно эукариотическую клетку, в частности грибную клетку, такую, как дрожжевая клетка, или клетку нитевидного гриба, такого как клетка штамма Aspergillus, Fusarium, Trichoderma или Saccharomyces, в особенности A. niger, A. oryzae, F. venenatum, F. sambucinum, F. cerealis или S. cerevisiae, например, штамм A. niger, продуцирующий глюкоамилазу, такой как штаммы, описанные в US 3677902, или их мутанты. Продуцирование фосфолипазы в таком организме-хозяине может быть обеспечено при использовании основных методик, описанных в EP 238 023 (Novo Nordisk), WO 96/00787 (Novo Nordisk) или EP 244 234 (Alko).

Вектор экспрессии по настоящему изобретению обычно включает управляющие последовательности, функционирующие в качестве промотора, сигнала инициации трансляции и необязательно селектируемый маркер, терминатор транскрипции, ген-репрессор или различные гены-активаторы. Вектор может представлять собой автономно реплицирующийся вектор или он может быть интегрирован в геном хозяйской клетки.

Сопоставление последовательностей и определение идентичности

Сопоставление (выравнивание) нуклеотидных последовательностей может быть осуществлено с использованием приложения AlignX программы Vector NTI Program Suite 7,0 с использованием заданных по умолчанию установок, в которых используется модифицированный алгоритм ClustalW (Thompson, J.D., Higgins, D.G., and Gibson T.J. (1994) Nuc. Acid. Res. 22: 4673-4680), матрица swgapdnarnt score matrix, штраф за наличие гэпа 15 и штраф за продолжение гэпа 6,66.

Сопоставление аминокислотных последовательностей может быть осуществлено при использовании приложения AlignX программы Vector NTI Program Suite v8 с использованием заданных по умолчанию установок, в которых используется модифицированный алгоритм ClustalW (Thompson, J.D., Higgins, D.G., and Gibson T.J. (1994)), матрица blosum62mt2 score matrix, штраф за наличие гэпа 10 и штраф за продолжение гэпа 0,1.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения сопоставление последовательностей и расчет балльных показателей гомологии производят с использованием метода Липмана-Пирсона (Lipman, D.J., and W.R. Pearson (1985) Rapid and sensitive protein similarity searches. Science 227: 1435-1441) с использованием таблицы весовых значений остатков PAM250 (Dayhoff, M.O., R.M. Schwartz and B.C. Orcutt (1978) A model of evolutionary change in proteins. In Dayhoff M.O. (ed.), Atlas of Protein Sequence and Structure. National Biomedical Research Foundation. Washington, D.C. Vol. 5. Suppl. 3: pp. 345-358) с использованием заданных по умолчанию установок в программе MegAlign v4.03, инсталированной в пакет прикладных программ Lasergene (DNASTAR Inc., 1228 South Park Street, Madison, Wisconsin 53715). Заданные по умолчанию установки включают параметр K-tuple, равный 2, штраф на наличие гэпа 4 и штраф на удлинение гэпа 12.

Гидролиз фософолипида

Практическое осуществление настоящего изобретения включает использование при гидролизе фосфолипида, такого как лецитин, цефалин или инозитид.

Изобретение может быть использовано по аналогии с имеющимися в технике процессами, путем замены фосфолипазы, например, в процессе производства хлебобулочных изделий (WO 0032758, WO 9953769), майонезов (GB 1525929, US 4034124) или при обработке растительного масла (US 5264367).

Использование фосфолипазы

Фосфолипаза по настоящему изобретению может использоваться в различных промышленных процессах, включающих фосфолипазы, например, как описано ниже.

Использование в хлебопечении

Фосфолипаза по настоящему изобретению может использоваться при изготовлении теста, хлеба и кексов, например, для повышения эластичности хлеба или кексов. Таким образом, фосфолипаза может использоваться в процессе хлебопечения, включающем добавление фосфолипазы к ингредиентам теста, перемешивание теста и выпечку теста, с получением хлеба. Указанный процесс может быть осуществлен по аналогии с процессом, описанным в US 4567056 или WO 99/53769.

Использование в детергентных материалах

Один из вариантов фосфолипазы может использоваться в качестве детергентной добавки, например, в концентрации (выражаемой в виде чистого ферментного белка) 0,001-10 (например, 0,01-1) мг на грамм детергента или 0,001-100 (например 0,01-10) мг на литр моющей жидкости.

Детергентная композиция по настоящему изобретению может быть, например, изготовлена в виде детергентной добавки, которая применяется при ручной или машинной стирке и которая включает композицию добавки для стирки, подходящую для предварительной обработки окрашенных материалов, и смягчающую композицию для полоскания, или может быть изготовлена в виде детергентной композиции, применяемой в домашнем хозяйстве для очистки сильно загрязненных поверхностей. В составе детергентной композиции для стирки данный вариант может быть эффективным для использования с целью удаления жирных пятен, для отбеливания и для чистки мебели. Детергентная композиция для стирки может быть изготовлена по методике, описанной в GB 2247025, WO 9901531 или WO 9903962.

Детергентная композиция по настоящему изобретению может быть, в частности, изготовлена в виде, подходящем для ручного или машинного мытья посуды, например, как описано в GB 2 247 025 (Unilever) или WO 99/01531 (Procter & Gamble). В композиции для мытья посуды данный вариант может быть эффективным для удаления жирных/масляных пятен, для предупреждения потемнения/обесцвечивания посуды и полимерных компонентов посуды сильно окрашенными компонентами и для избежания отложения мыла на посуде.

Другие варианты использования

Фосфолипаза по настоящему изобретению может использоваться для улучшения фильтруемости водного раствора или взвеси, получаемых из углеводов после обработки их фосфолипазой. Такая процедура особенно применима к раствору или взвеси, содержащих крахмальный гидролизат, в особенности гидролизат пшеничного крахмала, поскольку он труднее фильтруется и образует мутные фильтраты. Обработка может быть проведена по методике, аналогичной методике, описанной в EP 219 269 (СPC International).

Кроме того, фосфолипаза по настоящему изобретению может использоваться для частичного гидролиза фосфолипидов, предпочтительно лецитина, для получения улучшенных фосфолипидных эмульгаторов. Данный вариант применения описан в энциклопедии Ульмана (Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (Publisher: VCH Weinheim (1996)), патент JP 2794574 и JP-B 6-087751).

Кроме того, фосфолипаза по настоящему изобретению может использоваться в способе получения корма для животных, который включает перемешивание фосфолипазы с кормовыми веществами и по меньшей мере с одним фосфолипидом. Указанная процедура может быть осуществлена по аналогии с методикой, описанной в EP 743 017.

В еще одном варианте фосфолипаза по настоящему изобретению может использоваться в способе снижения содержания фосфолипидов в пищевом масле, который включает обработку масла фосфолипазой, так что достигается гидролиз основной части фосфолипида, и отделение водной фазы, содержащей гидролизованный фосфолипид, от масла. Данный процесс применим к очистке любого пищевого масла, которое содержит фосфолипид, например, растительного масла, такого как соевое масло, рапсовое масло и подсолнечное масло. Фосфолипаза может, например, использоваться в способах, описанных в JP-A-2-153997 и US 5264367.

Способ получения сыра

Фосфолипаза по настоящему изобретению может использоваться для получения сыра по способу, аналогичному способу, приведенному в US 6399121.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения сыр изготавливают при взаимодействии молока для сыроделия или фракции молока для сыроделия с фосфолипазой по настоящему изобретению с последующим получением сыра из молока для сыроделия.

В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения сыр изготавливают при взаимодействии молока для сыроделия или фракции молока для сыроделия с фосфолипазой, где указанная фосфолипаза включает:

а) последовательность, приведенную на участке аминокислот 146-153 в SEQ ID NO: 1, аминокислот 87-94 в SEQ ID NO: 3, аминокислот 79-86 в SEQ ID NO: 12; или последовательность, идентичную любой из указанных аминокислотных последовательностей, за исключением замещения одной аминокислоты другой аминокислотой; и

b) два цистеиновых остатка, расположенных на N-концевой стороне последовательности, приведенной в а); и

c) два цистеиновых остатка, расположенных на С-концевой стороне последовательности, приведенной в а).

В контексте настоящего описания термин «молоко для сыроделия» следует понимать как относящийся к любой композиции на основе молока, используемой для производства сыра. Фракция молока для сыроделия может быть любой фракцией молока для сыроделия, такой как, например, сливки, сепарированное молоко, молоко, пахта, масло или молочный жир.

В предпочтительном варианте молоко для сыроделия или фракцию молока для сыроделия подвергают взаимодействию с фосфолипазой по настоящему изобретению в количестве, достаточном для снижения эффекта промасливания в сыре и/или для повышения выхода сыра. Эффект промасливания относится к тенденции сыра выделять масло при хранении и/или расплавлении.

В одном аспекте настоящее изобретения относится к способу изготовления сыра, включающему обработку молочной композиции фосфолипазой по настоящему изобретению, с последующим получением сыра из молочной композиции.

Другой аспект настоящего изобретения относится к способу изготовления сыра, включающему обработку молочной композиции фосфолипазой, с последующим получением сыра из молочной композиции, где фосфолипазу выбирают из грибных/бактериальных фосфолипаз PLA2 группы XIII. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения грибная/бактериальная PLA2 из группы XIII представляет собой фосфолипазу из гриба, более предпочтительно из гриба, относящегося к Ascomycetes. Фосфолипаза, принадлежащая к грибной/бактериальной PLA2 группы XIII, может быть любой фосфолипазой, принадлежащей к данной группе в соответствии с определением Сораньи с соавт. (Soragni, E., et al., (2001) EMBO Journal, 20:5079-5090), и может представлять собой фосфолипазу из любого вида Tube, например, T. borchii; Streptomyces, например, S. coelicor; Verticillium, например, V. dahliae; Aspergillus, например, A. oryzae; Neurospore, например, N.crassa или Helicosporum.

Молочная композиция по настоящему изобретению может представлять собой любую композицию, включающую компоненты молока. Компоненты молока могут быть такими компонентами молока, как молочный жир, молочный белок, казеин, белок сыворотки и лактоза. Молочная фракция может представлять любую фракцию молока, такую как, например, снятое молоко, пахта, сыворотка, сливки, молочный порошок, порошок цельного молока, порошок из снятого молока. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения молочная композиция включает молоко, снятое молоко, пахту, цельное молоко, сыворотку, сливки или любое их сочетание. В более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения молочная композиция состоит из молока, такого как снятое молоко, цельное молоко, сливки, пахта или их любое сочетание.

Ферментативная обработка, осуществляемая в соответствии со способом настоящего изобретения, может проводиться путем диспергирования фосфолипазы в молочной композиции в условиях, позволяющих действие фермента, включающих соответствующее время выдерживания и подходящую температуру. Обработка фосфолипазой может проводиться в условиях, выбранных в соответствии с выбранным(ыми) ферментом(ами), на основе подходов, известных в данной области.

Ферментативная обработка может проводиться при любом подходящем pH, таком как, например, pH в диапазоне значений 2-10, таком как pH 4-9 или 5-7. В одном варианте обработку фосфолипазой проводят при температуре 3-60°С, такой как 25-45°С (например, в течение по меньшей мере 5 минут, в частности, в течение по меньшей мере 10 минут или по меньшей мере 30 минут, например, в течение 5-120 минут). Фосфолипазу добавляют в подходящем количестве, с тем чтобы достичь желательных свойств получаемого сыра. Предпочтительно фосфолипазу добавляют в количестве, эффективном для снижения эффекта промасливания сыра и/или для повышения выхода сыра. Подходящая дозировка фосфолипазы обычно укладывается в диапазон 0,001-0,5 мг ферментного белка на г молочного жира, предпочтительно в диапазон 0,01-0,3 мг ферментного белка на г молочного жира и более предпочтительно в диапазон 0,02-0,1 мг ферментного белка на г молочного жира.

Сыры, получаемые по способу настоящего изобретения, включают все виды сыра, такие как сыр кампезино, сыр честер, сыр данбо, сыр драбант, сыр херрегард, сыр манчего, сыр проволонский, сыр сан-полен, мягкий сыр, сыр шведский, сыр таледжо, белый сыр, включая творожно-сычужный сыр, сыр, получаемый при сычужном свертывании творога; зрелые сыры, такие как сыр чеддер, сыр колби, эдамский сыр, мюнстерский сыр, сыр грюйер, эмментальский сыр, сыр камамбер, сыр пармезан и сыр романо; голубой сыр, такой как датский голубой сыр; свежие сыры, такие как сыр фета; сыры, получаемые в процессе свертывания с добавлением кислоты, такие как сливочный сыр, сыр невшатель, сыр гуарг, домашний сыр и квезо бланко. В предпочтительном варианте настоящее изобретение относится к способу получения сыра паста филата, такого как, например сыр моцарелла и сыр пицца. Сыр паста филата, или тянущаяся сырная масса, обычно отличается уникальными пластифицирующими способностями и способностью поддаваться обработке путем проминания свежей сырной массы в горячей воде, которая придает готовому сыру его характерную волокнистую структуру и способностью к плавлению и растяжению (см., например, «Mozzarella and Pizza cheesе» by Paul S. Kindstedt, Chees: Chemistry, physics and microbiology, Volume 2: Mаjor Cheesе Groups, Second edition, page 337-341, Chapmаn & Hall).

Перечень последовательностей и депонированные микроорганизмы

Настоящее изобретение содержит информацию в виде перечня последовательностей, внесенного в описание, а также представленного на машиночитаемом носителе, прилагаемом к данной заявке. Кроме того, настоящее изобретение относится к депонированным микроорганизмам. Содержание машиночитаемого носителя данных и информации о депонированных микроорганизмах полностью включены в настоящее описание в качестве ссылки.

Депонирование биологического материала

Приведенный ниже биологический материал был депонирован в соответствии с условиями Будапештского договора в Коллекции микроорганизмов и клеточных культур в Германии (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmBH, Mascheroder Weg 1 B, D-38124 Braunschweig, Germany) и имеет следующие номера доступа:

Депозит	Номер доступа	Дата депонирования
E. coli	DSM 15441	12 февраля 2003 года
E coli	DSM 15442	12 февраля 2003 года

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Среды и субстраты

Среда YP+2%G

10 г дрожжевого экстракта

20 г пептона

вода до 1 литра.

Проводят автоклавирование при температуре 121°С в течение 20 минут, добавляют 100 мл 20% стерильного раствора глюкозы.

Среда RA для споруляции

50 г янтарной кислоты

12,1 г нитрата натрия

1 г глюкозы

20 мл 50х соли Фогеля (Davis, R.H and F.J. de Serres (1970), Meth. Enzymol. 17A:79-143)

Все компоненты перемешивают в одном литре дистиллированной воды и фильтруют в стерильных условиях.

Буфер Бриттона-Робинсона

0,023 М фосфорная кислота

0,023 М уксусная кислота

0,023 М борная кислота

Титруют с использованием NaOH или HCl до нужного pH.

Методы

Фосфолипазная активность (LEU)

Лецитин гидролизуют при постоянных значениях pH и температуры и определяют активность фосфолипазы как уровень потребления титрующего агента (0,1 N NаOH), добавляемого для нейтрализации высвобожденной жирной кислоты.

Субстрат представляет собой соевый лецитин (L-α-фосфатидилхолин) и условия обработки включают: pH 8,00, температура 40,0°С и длительность реакции 2 минуты. Величину активности в единицах определяют при сравнении со стандартом.

ПРИМЕРЫ

Пример 1: Экспрессия фосфолипазы А2 из Tuber albidum в Aspergillus oryzae

На основе последовательности ДНК, описанной Сораньи с соавт. (Soragni, E., et al., (supra)), разрабатывают праймеры для проведения реакции амплификации TbSP1 по методу ПЦР на основе геномной ДНК с введением на концы праймера соответствующих сайтов рестрикции для облегчения клонирования продукта ПЦР (SEQ ID NO: 13 и 14). Штамм Tuber albidum CBS 272.72 получают из Коллекции культур CBS в Нидерландах (Centraalbureau voor Schimmelkultures, Utecht, The Netherlands) и культивируют на X-агаре при 20°С, в соответствии с рекомендациями CBS, приведенными в перечне культур 1996 года. Отбирают мицелий с поверхности чашек Петри и выделяют суммарную ДНК с использованием набора FastDNA Spin Kit (BIO101, Inc., Vista, CA), в соответствии с инструкциями производителя. Амплификацию по методу ПЦР проводят с использованием основной смеси Extensor Hi-Fidelity PCR Master Mix (ABgene, Surrey, U.K.) в соответствии с инструкциями производителя и используют для отжига при температуре 52°С в течение первых 5 циклов и при 62°С в течение последних 25 циклов. Получают один продукт ПЦР и определяют последовательность, которая представлена в виде SEQ ID NO: 9, за исключением добавленных синтетических сайтов рестрикции. Сравнение данной геномной последовательности с последовательностью к ДНК, описанной Сораньи с соавт. (Е. Soragni, et al.), указывает на наличие единственного интрона. После удаления интрона нуклеотидная последовательность из T. albidum СBS272.72 становится на 92,5% идентична последовательности из T. borchii ATCC 96540, штамма, который был использован Сораньи с соавт. (Е. Soragni, et al.). Соответствующий пептид, предсказанный на основании генной последовательности из T. albidum СBS272.72, на 93,8% идентичен пептидной последовательности, сообщенной Сораньи с соавт. (Soragni et al.).

Фрагмент ПЦР подвергают рестрикции с использованием BamHI и XhoI и клонируют в векторе экспрессии Aspergillus pMStr57 с использованием стандартных методик. Вектор экспрессии pMStr57 содержит те же элементы, что и pCaHj483 (WO 98/00529) с небольшими модификациями, введенными в промотор Aspergillus Na2, и содержит последовательности, подходящие для селекции и размножения в E. coli, а также для селекции и экспрессии в клетках Aspergillus. Конкретно, селекцию в Aspergillus осуществляют по гену amdS из Aspergillus nidulans, который позволяет использовать ацетамид в качестве единственного источника азота. Экспрессия а клетках Aspergillus связана с вовлечением промотора модифицированной нейтральной амилазы II (NA2) из Aspergillus niger, который слит с 5'-лидерной последовательностью гена из Aspergillus nidulans, кодирующего триозофосфатизомеразу (tpi), и с терминатором из гена Aspergillus niger, кодирующего амилоглюкозидазу. Ген, кодирующий фосфолипазу А2, в полученной конструкции экспрессии Aspergillus, pMStr70 секвенируют и полученную последовательность сравнивают с последовательностью, определенной ранее для не клонированного фрагмента ПЦР, SEQ ID NO: 9. Единственная мутация Т на С была найдена на расстоянии 52 н.п. в направлении по ходу транскрипции от стоп-кодона.

Клетки Aspergillus oryzae трансформируют с использованием pMStr70 в рамках стандартных методик, описанных в работе Кристенсена с соавт. (T. Christensen et al., (1988), BioTechnology 6, 1419-22). Трансформанты культивируют в среде YP+2%G со вст